Etablierung und Charakterisierung eines prävaskularisierten in vitro Schleimhaut-Äquivalents
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Tissue Engineering beschreibt die in vitro-Generierung künstlicher Gewebe mit autologen Zellen des jeweiligen Patienten. In der Regenerativen Medizin gewinnt dieses Gebiet eine immer größere Bedeutung im Kontext der operativen Geweberekonstruktion zur Therapie er¬wor¬bener und angeborener Fehlbildungen sowie zur Wundabdeckung und Unter¬stüt¬zung der Wundheilung. Der Einsatz von größeren, mittels Tissue Engineering generierten Gewebe-Äqui¬va¬len¬ten ist derzeit noch limitiert durch eine nicht ausreichend schnelle Vasku¬lari¬sie¬rung nach Transplantation. Diese führt, aufgrund der mangelnden Versorgung mit Sauer¬stoff und Nähr¬stoffen, zu Nekrosen und Abstoßung des Transplantats. Eine Prävaskularisierung von Gewebe-Konstrukten bereits in vitro durch den Einsatz mikro¬vas-ku¬lärer Endothelzellen stellt eine vielversprechende Alternative dar, um dieser Problematik ent¬gegen¬zu¬wir¬ken.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung und Charakterisierung eines prä¬vas¬ku¬lari-sier¬ten Schleimhaut-Äquivalents in Trikultur unter Verwendung von mikrovaskulären Endo-thel¬zellen sowie oralen Epithelzellen und Fibroblasten. In einem ersten Schritt wurde die Isolation und Kultivierung der primären Zellen etabliert, die im Weiteren für die Gene¬rie-rung der Gewebe-Äquivalente eingesetzt wurden. In diesem Kontext wurden ver¬schie¬dene Besiedlungsparameter analysiert und optimiert, um eine zuverlässige Prä¬vas¬kulari¬sie¬rung und Epithelialisierung zu garantieren. Eine vorangehende Besiedlung mit Fibro¬blasten war in Ko- wie auch Trikultur für die Bildung einer Prä¬vas¬kula¬ri¬sie¬rung und eines Epi¬the¬liums förder¬lich, vermutlich aufgrund der von den Fibroblasten sezer¬nier¬ten Wachs¬tums¬faktoren. Hinsichtlich dieser beiden Charakteristika eignete sich zudem eine Be¬sied¬lung mit Epithelzellen sieben Tage vor den mikrovaskulären Endothelzellen am besten.
Zur Analyse der interzellulären Kommunikation innerhalb solcher Gewebe-Äquivalente wurden im Multi Cytokine ELISA pro-angiogene Wachstumsfaktoren selektioniert und ihre Sekre¬tion im Schleimhaut-Konstrukt zu verschiedenen Zeitpunkten quanti¬fiziert. In der Kultur¬schale förderte die Kokultivierung gegenüber der Monokultur die endotheliale Sekre-tion von VEGF, bFGF, eNOS und Ang-2 sowie die fibroblastäre Sekretion von bFGF und Ang 2. Eine räumlich getrennte Kokultivierung bewirkte bei den Endothelzellen eine ver-stärk¬te Sekre¬tion von VEGF, bFGF und eNOS, bei den Fibroblasten eine ge¬stei¬ger¬te Aus-schüt¬tung von VEGF, bFGF, eNOS und Ang 2 im Vergleich zu den Kokul¬turen mit direktem zellu¬lärem Kontakt. In allen Ansätzen konnte ein komplexes Zusam¬men¬spiel der analy¬sier-ten Faktoren im Kontext der Prävas¬kulari¬sie¬rung beobachtet werden.
Zusätzlich hatte die dreidimensionale Kollagen¬mem¬bran einen stark fördernden Einfluss auf die Sekretion aller analysierten Zytokine. Dieser überstieg für VEGF die Stimulation durch die Kokul¬ti¬vie-rung. Die Sekretion von bFGF und eNOS wurde durch die Membran und die Kokulti¬vie¬rung annähernd gleich stark stimuliert. Diese Erkenntnisse geben Auf¬schluss über die inter¬zellu-lären Wechselwirkungen innerhalb des Schleimhaut-Äqui¬va¬lents und die Beteiligung der einzelnen Zytokine an dessen Prävaskularisierung.
Im Folgenden konnte eine Stimulation von zellulären Parametern, die im Kontext der Angio-genese essentiell sind, durch VEGF, IL 8 und bFGF nachgewiesen werden. Eine Be¬hand¬lung mit diesen Zytokinen führte zu einer durchgehenden Steigerung der endo¬thelia¬len Vitalität, Proliferation, chemotaktische Migration sowie verschiedener angio¬gener Eigenschaften im Tube Formation Assay. Im kokultivierten Schleimhaut-Äquivalent führte eine Stimulation mit VEGF und IL 8 zu einer schnelleren und dichteren Ausbildung der Prä¬vas¬kula¬ri¬sierung.
Abschließend wurde eine erfolgreiche Anastomose von in vitro prävaskularisierten Schleim-haut-Äqui¬va¬len¬ten in Ko- und Trikultur an das Blutgefäßsystem der Maus bzw. der CAM von Hühnerembryonen nach¬ge¬wiesen. Bereits fünf Tage nach Transplantation konnten murine bzw. aviäre Ery¬thro¬zyten in den gefä߬ähnlichen Strukturen der Schleim¬haut-Konstrukte detektiert werden. Zehn Tage nach Trans¬plan¬tation zeigte sich eine dichte Vasku¬lari-sierung, gebildet aus humanen Endo¬thel¬zellen, mit durchgehender Invasion muriner Blutzellen.
Es konnte somit erfolgreich ein prävaskularisiertes und epithelialisiertes Schleimhaut-Äquivalent in vitro generiert werden, das nach Transplantation in vivo eine zeitnahe Anbindung an das Blutgefäßsystem erfuhr. Des Weiteren wurde die interzelluläre Kommunikation in solchen Konstrukten analysiert, um grundlagenwissenschaftliches sowie anwendungsbezogenes Verständnis der Vaskularisierungsmechanismen zu erlangen. Für die Zytokine VEGF und IL 8 konnte ein positiver Einfluss auf die Prävaskularisierung in Schleimhaut-Äquivalenten demonstriert werden. Die vorliegende Arbeit trägt damit dazu bei, prävaskularisierte Schleimhaut-Äqui¬valen¬te der klinischen Routine näher zu bringen.