Authors:	Bauer, Heide-Katharina Helene
Title:	Etablierung und Charakterisierung eines prävaskularisierten in vitro Schleimhaut-Äquivalents
Online publication date:	22-Feb-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Tissue Engineering beschreibt die in vitro-Generierung künstlicher Gewebe mit autologen Zellen des jeweiligen Patienten. In der Regenerativen Medizin gewinnt dieses Gebiet eine immer größere Bedeutung im Kontext der operativen Geweberekonstruktion zur Therapie er¬wor¬bener und angeborener Fehlbildungen sowie zur Wundabdeckung und Unter¬stüt¬zung der Wundheilung. Der Einsatz von größeren, mittels Tissue Engineering generierten Gewebe-Äqui¬va¬len¬ten ist derzeit noch limitiert durch eine nicht ausreichend schnelle Vasku¬lari¬sie¬rung nach Transplantation. Diese führt, aufgrund der mangelnden Versorgung mit Sauer¬stoff und Nähr¬stoffen, zu Nekrosen und Abstoßung des Transplantats. Eine Prävaskularisierung von Gewebe-Konstrukten bereits in vitro durch den Einsatz mikro¬vas-ku¬lärer Endothelzellen stellt eine vielversprechende Alternative dar, um dieser Problematik ent¬gegen¬zu¬wir¬ken. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung und Charakterisierung eines prä¬vas¬ku¬lari-sier¬ten Schleimhaut-Äquivalents in Trikultur unter Verwendung von mikrovaskulären Endo-thel¬zellen sowie oralen Epithelzellen und Fibroblasten. In einem ersten Schritt wurde die Isolation und Kultivierung der primären Zellen etabliert, die im Weiteren für die Gene¬rie-rung der Gewebe-Äquivalente eingesetzt wurden. In diesem Kontext wurden ver¬schie¬dene Besiedlungsparameter analysiert und optimiert, um eine zuverlässige Prä¬vas¬kulari¬sie¬rung und Epithelialisierung zu garantieren. Eine vorangehende Besiedlung mit Fibro¬blasten war in Ko- wie auch Trikultur für die Bildung einer Prä¬vas¬kula¬ri¬sie¬rung und eines Epi¬the¬liums förder¬lich, vermutlich aufgrund der von den Fibroblasten sezer¬nier¬ten Wachs¬tums¬faktoren. Hinsichtlich dieser beiden Charakteristika eignete sich zudem eine Be¬sied¬lung mit Epithelzellen sieben Tage vor den mikrovaskulären Endothelzellen am besten. Zur Analyse der interzellulären Kommunikation innerhalb solcher Gewebe-Äquivalente wurden im Multi Cytokine ELISA pro-angiogene Wachstumsfaktoren selektioniert und ihre Sekre¬tion im Schleimhaut-Konstrukt zu verschiedenen Zeitpunkten quanti¬fiziert. In der Kultur¬schale förderte die Kokultivierung gegenüber der Monokultur die endotheliale Sekre-tion von VEGF, bFGF, eNOS und Ang-2 sowie die fibroblastäre Sekretion von bFGF und Ang 2. Eine räumlich getrennte Kokultivierung bewirkte bei den Endothelzellen eine ver-stärk¬te Sekre¬tion von VEGF, bFGF und eNOS, bei den Fibroblasten eine ge¬stei¬ger¬te Aus-schüt¬tung von VEGF, bFGF, eNOS und Ang 2 im Vergleich zu den Kokul¬turen mit direktem zellu¬lärem Kontakt. In allen Ansätzen konnte ein komplexes Zusam¬men¬spiel der analy¬sier-ten Faktoren im Kontext der Prävas¬kulari¬sie¬rung beobachtet werden. Zusätzlich hatte die dreidimensionale Kollagen¬mem¬bran einen stark fördernden Einfluss auf die Sekretion aller analysierten Zytokine. Dieser überstieg für VEGF die Stimulation durch die Kokul¬ti¬vie-rung. Die Sekretion von bFGF und eNOS wurde durch die Membran und die Kokulti¬vie¬rung annähernd gleich stark stimuliert. Diese Erkenntnisse geben Auf¬schluss über die inter¬zellu-lären Wechselwirkungen innerhalb des Schleimhaut-Äqui¬va¬lents und die Beteiligung der einzelnen Zytokine an dessen Prävaskularisierung. Im Folgenden konnte eine Stimulation von zellulären Parametern, die im Kontext der Angio-genese essentiell sind, durch VEGF, IL 8 und bFGF nachgewiesen werden. Eine Be¬hand¬lung mit diesen Zytokinen führte zu einer durchgehenden Steigerung der endo¬thelia¬len Vitalität, Proliferation, chemotaktische Migration sowie verschiedener angio¬gener Eigenschaften im Tube Formation Assay. Im kokultivierten Schleimhaut-Äquivalent führte eine Stimulation mit VEGF und IL 8 zu einer schnelleren und dichteren Ausbildung der Prä¬vas¬kula¬ri¬sierung. Abschließend wurde eine erfolgreiche Anastomose von in vitro prävaskularisierten Schleim-haut-Äqui¬va¬len¬ten in Ko- und Trikultur an das Blutgefäßsystem der Maus bzw. der CAM von Hühnerembryonen nach¬ge¬wiesen. Bereits fünf Tage nach Transplantation konnten murine bzw. aviäre Ery¬thro¬zyten in den gefä߬ähnlichen Strukturen der Schleim¬haut-Konstrukte detektiert werden. Zehn Tage nach Trans¬plan¬tation zeigte sich eine dichte Vasku¬lari-sierung, gebildet aus humanen Endo¬thel¬zellen, mit durchgehender Invasion muriner Blutzellen. Es konnte somit erfolgreich ein prävaskularisiertes und epithelialisiertes Schleimhaut-Äquivalent in vitro generiert werden, das nach Transplantation in vivo eine zeitnahe Anbindung an das Blutgefäßsystem erfuhr. Des Weiteren wurde die interzelluläre Kommunikation in solchen Konstrukten analysiert, um grundlagenwissenschaftliches sowie anwendungsbezogenes Verständnis der Vaskularisierungsmechanismen zu erlangen. Für die Zytokine VEGF und IL 8 konnte ein positiver Einfluss auf die Prävaskularisierung in Schleimhaut-Äquivalenten demonstriert werden. Die vorliegende Arbeit trägt damit dazu bei, prävaskularisierte Schleimhaut-Äqui¬valen¬te der klinischen Routine näher zu bringen. In the field of Regenerative Medicine, Tissue Engineering of artificial constructs utilizing autologous cells of the respective patient becomes more and more important. This is relevant especially for reconstruction surgeries to treat inherited and acquired malformations or to cover and support wounded tissue. The use of larger tissue equivalents generated with the use of Tissue Engineering methods is to date limited by a delayed and/or insufficient vascularization after transplantation in the patient. Thereby, the con-structs lack nutrient and oxygen supply, which often leads to necrosis and graft rejection. A promising approach to counteract these problems is the generation of an in vitro pre-vascularization inside the construct by the use of microvascular endothelial cells. The main objective of this thesis was the in vitro establishment and characterization of a functionally pre-vascularized mucosa equivalent in triculture using microvascular endo-thelial cells, oral epithelial cells and fibroblasts. Initially, the isolation and cultivation of the involved cell types had to be established. Afterwards, several cultivation parameters were tested to ensure ideal conditions for all cell types and an optimal generation of the tissue equivalent. A preceding cultivation of the con¬structs with fibroblasts showed best results regarding the development of capillary-like structures (CLS) and an epithelium, followed by a seeding of epithelial cells seven days prior to endothelial cultivation. The growth factors secreted by the fibroblasts in the period before other cells were co- or tri-cultured presumably established a suitable milieu to promote the desired characteristics. The next aim was to analyze the intercellular communication in such tissue equivalents with regard to optimize the prevascularization. The secreted pro-angiogenic cytokines VEGF, IL 8, bFGF, eNOS and Ang 2 were selected and quantified in the supernatant of different mono- and cocultures of endothelial cells and fibroblasts. Co-cultivations fostered the endothelial secretion of VEGF, bFGF, eNOS and Ang 2 as well as the secretion of bFGF and Ang 2 by fibroblasts. Furthermore, cultivation without direct intercellular contact led to an increased secretion of VEGF, bFGF and eNOS by endothelial cells and a higher secreted amount of VEGF, bFGF, eNOS and Ang 2 by fibroblasts compared with co-cultures with direct cellular contact. In all approaches, a complex interaction of the analyzed molecules was observed. The threedimensional collagen membrane additionally stimulated the cytokine secretion. This effect exceeded the stimulation of the co-cultivation for VEGF and showed great impact on the secretion of IL-8. The secretion of bFGF and eNOS were stimulated similarly by the collagen membrane and the co-cultivation. These findings help understanding the cellular interactions in the context of tissue equivalents and the involvement of each individual cytokine in their prevascularization. Hereafter, the effect of VEGF, IL 8 and bFGF on cellular parameters that are crucial in the context of angiogenesis was analyzed. The treatment of microvascular endothelial cells with these cytokines promoted cell vitality, proliferation and chemotactic migration as well as angiogenic parameters in tube formation assays. When the cocultured mucosa equivalent was cultivated in media containing VEGF and/or IL 8, a faster and denser prevascularisation was achieved. Finally, we demonstrated a successful anastomosis of the in vitro prevascularized mucosa equivalents in co- and triculture to the vascular system of mice and the chorioallantoic mem¬brane (CAM) of fertilized hen’s eggs. Only five days after implantation, murine and avian blood cells could be detected inside the construct’s CLS. Ten days after implantation, we observed a dense vascularization of CLS built by human endothelial cells with continuous invasion of murine erythrocytes. In conclusion, an in vitro mucosa equivalent with prevascularization and epithelium was generated successfully. The construct showed a fast anastomosis to the host’s vascu¬la¬ture after transplantation. Furthermore, the intercellular communication in such con¬structs was analyzed to contribute to basic and application-oriented knowledge. The cytokines VEGF and IL 8 showed a positive effect on the establishment of a prevascularization inside the equivalents. Thereby, the present thesis contributes to establish prevascularized mucosa equivalents for the use in clinical applications.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2628
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000019115
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	III, 231 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen