Authors:	Rühle, Sabine
Title:	From gene structure to neuronal circuits : genetic rescue of CB1 receptor function in cortical glutamatergic networks
Online publication date:	15-Feb-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	A main topic of current neurobiological research is to establish causal relationships between genes, molecules and functions. Several studies using knock-out and pharmacological approaches showed the necessary role of the cannabinoid type 1 (CB1) receptor in a plethora of cellular neuronal functions and behaviors. However, caused by technological limitations, the sufficient role of the CB1 receptor in the same processes has not been established yet. To further understand the mechanisms underlying these processes, a novel mouse line for cell type-specific rescue from CB1 receptor deficiency (Stop-CB1) was generated. To this end, a loxP-flanked stop cassette was introduced into the CB1 receptor gene locus in order to repress CB1 receptor expression throughout the entire body, including the brain. By crossing this mouse line with a mouse line ubiquitously expressing Cre recombinase (Ella-Cre), complete and functional reactivation of CB1 receptor expression by excision of the stop cassette was demonstrated by histological, electrophysiological and behavioral analyses. To further address the role of intact CB1 receptor signaling in specific neuronal subpopulations, the Stop-CB1 line was crossed with a mouse line (Nex-Cre) expressing Cre recombinase selectively in cortical glutamatergic neurons and, thus, endogenous levels of CB1 receptor were reactivated cell-type specifically. Rescue of CB1 receptor expression in cortical glutamatergic neurons was sufficient to restore the alterations of global CB1 receptor deletion in food intake and was largely sufficient to restore normal levels of neuroprotection and innate anxiety. In contrast, rescue of the CB1 receptor on cortical glutamatergic neurons modified the time course of depolarization-induced suppression of excitation (DSE) in the amygdala and promoted sustained freezing behavior in auditory fear conditioning. These data revealed that the limited amount of CB1 receptor expressed in cortical glutamatergic neurons plays a key and sufficient role to modulate specific neuronal functions. The great majority of the studies investigating the role of the CB1 receptor to advance the knowledge for treatment of human pathologies have been carried out in mice. However, the molecular structure of the mouse Cnr1 gene coding for the CB1 receptor had been poorly characterized. In this thesis, the mouse Cnr1 gene was found to be more complex than previously described. It contains 7 exons separated by 6 introns and has two additional retained introns in the coding exon (exon 7). The Cnr1 gene produces several transcript variants in hippocampus, caudate putamen and cerebellum with different 5’ UTR exon assemblies. Splicing of the retained introns in the coding exon generates two novel splice variants with shortened N-termini that have different signaling efficiencies. These findings on the exon-intron structure of the mouse Cnr1 gene add to a better understanding of regulatory processes and allelic variations contributing to pathological phenotypes observed in the rodent model. Eine der wichtigsten Aufgaben der aktuellen neurobiologischen Forschung besteht darin, kausale Zusammenhänge zwischen Genen, Molekülen und Funktionen herzustellen. Die notwendige Rolle des Cannabinoid Typ 1 (CB1) Rezeptors wurde in etlichen Studien mit „Knock-out“-Mäusen und pharmakologischen Ansätzen gezeigt. Ob der CB1 Rezeptor in denselben Vorgängen jedoch auch eine hinreichende Rolle spielt, wurde aufgrund von technologischen Limitierungen noch nicht ermittelt. Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Vorgänge besser entschlüsseln zu können, wurde eine neuartige Mauslinie zur zelltypspezifischen Rekonstruktion des CB1 Rezeptors im Hintergrund einer CB1 Rezeptor Defizienz (Stop-CB1) generiert. Dazu wurde eine von loxP-Seiten flankierte Stop-Kassette in den Genlokus des CB1 Rezeptors eingebracht, um die Expression des CB1 Rezeptors im kompletten Körper inklusive des Gehirns zu unterdrücken. Durch das Kreuzen dieser Mauslinie mit einer Mauslinie mit ubiquitärer Expression der Cre Rekombinase (Ella-Cre), wurde die Stop-Kassette ausgeschnitten. Dass die daraus resultierende Reaktivierung der CB1 Rezeptor Expression vollständig und funktional ist, wurde mithilfe von histologischen, elektrophysiologischen und Verhaltens-Analysen bewiesen. Um zu untersuchen, welche Rolle eine intakte CB1 Rezeptor Signalwirkung in bestimmten Untergruppen von Neuronen spielt, wurde die Stop-CB1 Mauslinie mit einer Mauslinie verpaart, die Cre Rekombinase selektiv in glutamatergen Neuronen des Cortex exprimiert (Nex-Cre). Dadurch wurde der CB1 Rezeptor speziell in diesen Neuronen auf endogenem Niveau re-exprimiert. Die Rekonstruktion des CB1 Rezeptors in glutamatergen Neuronen des Cortex war hinreichend, um die durch kompletten Verlust des CB1 Rezeptors hervorgerufenen Veränderungen der Nahrungsaufnahme wiederherzustellen. Des Weiteren war die Rekonstruktion des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen fast hinreichend, um normale neuroprotektive Eigenschaften und normales Angstverhaltens wiederherzustellen. Im Gegensatz dazu wurde durch Rekonstruktion des CB1 Rezeptors in glutamatergen Neuronen des Cortex der zeitliche Ablauf der depolarisationsinduzierten Unterdrückung der Erregung („DSE“) in der Amygdala abgeändert. Einhergehend damit wurde das verlängerte Erstarren als Reaktion auf ein Furcht-konditioniertes Tonsignal gefördert. Diese Daten zeigen, dass der CB1 Rezeptor in glutamatergen Neuronen im Cortex trotz seiner geringen Menge eine Schlüsselrolle spielt und hinreichend ist um bestimmte neuronale Funktionen zu modulieren. Die große Mehrheit der Studien mit dem Ziel, die Bedeutung des CB1 Rezeptors zu erforschen, wurde mit Mäusen durchgeführt. Das aus diesen Studien gewonnen Wissen soll dazu dienen, Behandlungsmöglichkeiten für humane Pathologien zu entwickeln. Die molekulare Struktur des Maus Cnr1 Gens, das für den CB1 Rezeptor kodiert, war bisher jedoch nur schlecht charakterisiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass das Maus Cnr1 Gen komplexer ist, als es bisher beschrieben wurde. Es besteht aus 7 Exons, die von 6 Introns getrennt werden, und hat zwei weitere „retained“ Introns (Introns die beibehalten werden können) im Protein-kodierenden Exon (Exon 7). Das Cnr1 Gen produziert verschiedene Transkriptvarianten in Hippocampus, Caudate Putamen und Cerebellum mit unterschiedlicher Zusammensetzung der 5‘ nicht-translatierten Region. Spleißen der „retained“ Introns aus dem kodierenden Exon führt zu zwei bisher unbekannten Spleißvarianten mit kürzeren N-Termini und veränderten Signaltransduktionseigenschaften. Diese Erkenntnisse über die Exon-Intron-Struktur des Maus Cnr1 Gens tragen zum verbesserten Verständnis der im Mausmodell beobachteten pathologischen Phänotypen bei, da sie nun besser mit regulatorischen Prozesse und Variationen des Allels verknüpft werden können.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2625
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000019050
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	iv, 146 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen