Authors:	Trojan, Philipp
Title:	Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen
Online publication date:	22-Jul-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen. Centrins are small Ca2+-binding proteins containing four EF-hand motifs. Centrins were discovered as the major component of the flagellar rootlets in green algae. Meanwhile, centrins have been identified in all eukaryotic organisms. In mammals up to four isoforms are expressed, which are associated with centrosomes or centrosome related structures, like basal bodies of cilia, spindle poles of dividing cells and transition zones of cilia and flagella.. The present work revealed that centrins are not only regulated by Ca2+-binding but also via reversible phosphorylation in the cellular context of photoreceptor cells. In the retina of vertebrates centrins are phosphorylated during dark adaptation. These light-dependent phosphorylations are mediated by protein kinase CK2 (CK2). Although centrins contain several putative CK2 phosphorylation sites, Cen1p, Cen2p and Cen4p are phosphorylated only ones by CK2. In contrast, Cen3p is no substrate for CK2-mediated phosphorylation. Additionally, the present work identified for the first time protein phosphatases able to dephosphorylate centrins. The observed dephosphorylation by protein phosphatases PP2Cund PP2C was highly specific since no other retinal phosphatase was able to dephosphorylate centrins. High magnification light and electron microscopy revealed co-localization of centrins with CK2 as well as with PP2Cin the connecting cilium of photoreceptor cells. Since both, centrins and CK2 are able to bind directly to microtubules; the cytoskeleton itself provides a scaffold for specific enzyme and substrate reactions. Previous work showed that centrins interact with the visual G-protein transducin in a strictly Ca2+-dependent manner. This interaction is thought to regulate the light-dependent translocation of the visual G-protein from the outer segment to the inner segment of photoreceptor cells and vise versa. In the present work the binding affinity of centrins to the visual G-protein is drastically reduced by CK2-mediated phosphorylation. The decrease of the centrin/G-protein complex formation is due to the fact that CK2-mediated phosphorylation reduces the Ca2+-affinity of centrins. In summary, the present work identified a novel regulatory mechanism for the cellular function of centrins in vertebrate photoreceptor cells. Beside Ca2+-binding centrins are also regulated by CK2-mediated light-dependent phosphorylation. The phosphorylation of centrins reduces centrin/G-protein-formation and seems to regulate the light-dependent translocation of transducin in photoreceptor cells.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2609
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-16786
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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