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Authors: Poznanovic, Slobodan
Title: Quantitative differential proteomics for analysis of posttranslational modifications of proteins
Online publication date: 4-Jun-2008
Language: english
Abstract: In this work we developed a new and convenient method for high resolution IEF of proteins, which we termed: “daisy chain”. Usually an IEF is accomplished with IPG strips of a desired pH range. For high resolution focusing we are using strips with pH range, which covers only one or two pH units. Thereby the pro-teins, which have isoelectrical point outside of this pH range, are lost. We evalu-ated commercially available IPG strips with consecutive or overlapping pH ranges and connected them serially acidic to basic end, to construct in this way a high resolution IEF-system. For the first time, we showed that a high resolution IEF is possible in such a system and that results were by no means worse than those obtained when the same sample was analyzed on individual single IPGs. The great advantage of our system is that amount of sample used in serial IPG IEF is explicitly lower than when same sample was analyzed on individual single IPGs. This method was subsequently successfully applied to valuable clinical samples from cancer patients and to mitochondrial preparations related to a European project in gerontology. We thus developed a suite of experimental strategies, which adequately address complex biological situations, in particular on the level of protein expression.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue und effiziente Methode zur hoch-auflösenden Isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Proteinen entwickelt, die wir "daisy chain" nennen. Üblicherweise wird eine Fokussierung in IPG-Streifen mit einem gewünschten pH-Bereich durchgeführt. Für hochauflösende Fokussie-rungen werden Streifen verwendet, in denen der pH-Bereich nur ein oder zwei pH-Einheiten umfasst. Dabei gehen die Proteine, die einen isoelektrischen Punkt ausserhalb dieses pH-Bereichs sitzen verloren. Um diesen Probenverlust zu ver-hindern, untersuchten wir in Serie verbundene kommerziell erhältliche IPG-Streifen mit genau aufeinanderfolgenden oder überlappenden pH-Bereichen. Es wurde zum ersten Mal gezeigt, dass eine hochauflösende Fokussierung mit seriell verbundenen IPG-Streifen möglich ist. Die Ergebnisse waren gleichwertig mit Fo-kussierungen in einzelnen IGP-Streifen, aber mit dem Vorteil des deutlich redu-zierten Probenbedarfs. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich zur diffe-renziellen protemischen Analyse von wertvollen klinischen Tumorproben sowie von mitochondrialen Extrakten im Rahmen eines EU-geförderten Gerontologie-Projektes eingesetzt. In Verbindung mit dieser neuen, hochauflösenden IEF wur-den experimentelle Strategien entwickelt, mit denen Fragestellungen bezüglich der Proteinexpression in komplexen biologischen Systemen adequat addressiert werden können.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2575
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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