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Authors: Binzen, Uta
Title: Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte
Online publication date: 2-May-2008
Language: german
Abstract: Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.
Nociceptive dorsal root ganglion (DRG) neurons detect noxious stimuli, that are stimuli which can cause tissue damage, with different ligand- and voltage gated ion channels, convert them into action potential discharges und transmit them via the spinal cord to the brain, where the sensation of pain will be elicited. The pronociceptive transient receptor potential channels of the vanilloid receptor subtype, TRPV1 and TRPV2, are the classical transducer molecules for noxious heat stimuli in the DRG and are activated by stimulus temperatures of more than 43°C and 52°C, respectively. Antinociceptive membrane proteins are also expressed in the DRG, such as the metabotropic cannabinoid receptor CB1. CB1 is coupled to voltage-gated potassium channels which are also involved in the neuronal excitability like sodium and calcium channels. Of the voltage-gated potassium channels Kv1.4, who mediates a fast inactivating A-type current, could be involved in antinociceptive signal transduction pathways. To understand the molecular physiology of the regulation of nociception and antinociception, both the expression and co-expression of these membrane proteins and the functional properties of TRPV1 have been examined in the somata of DRG neurons and in a heterologous expression system. TRPV1 has been detected in about one third and TRPV2 in about a tenth of all DRG neurons. Their expression patterns did not differ between different methods of cell preparation, which are necessary for different experiments. Thus the results received from expression analyses and functional studies can be compared with each other. Despite the fact that TRPV1 and TRPV2 are expressed in cells with a different mean diameter, their size histograms overlap. By immunofluorescence double stainings it could be shown here for the first time that TRPV1-TRPV2-co-expressing DRG neurons exist. With the newly developed anti-TRPV1 monoclonal antibody (3C11), raised against the amino terminus, it has been demonstrated that different TRPV1-splice variants are existing. In addition to the already established splice variants a new variant Vr.3’sv has been isolated during this work. It exhibits an insertion of 104 nucleotides between exon 15 and 16 so that a different carboxy terminus will be expressed. But despite this modification functional channels could be formed in a heterologous expression system and in contrast to other splice variants they can be activated by capsaicin. As a homo- or heterotetramer Vr.3’sv could influence the properties of TRPV1-positive neurons. For the analysis of the frequency of TRPV1 it is thus very important which antibody will be chosen. Of TRPV2 no splice variants seems to exist. TRPV1 is activated by the vanilloid capsaicin, a neurotoxin which leads to the degeneration of neurons and epidermal nerve fibers. Here it has been shown that not all of TRPV1-positive neurons degenerate after a longlasting incubation with capsaicin irrespective the expression of different TRPV1 splice variants. Functional studies reveal that some capsaicin- sensitive cells recover from the action of the agonist. This protective mechanism will possibly be mediated by different splice variants. Co-expression analyses revealed that the voltage-gated potassium channel is expressed in nearly all TRPV1-positive neurons but not in the TRPV2-positive ones. Furthermore nearly all of the TRPV1-positive neurons co-express the cannabinoid receptor CB1. This nearly complete overlap of CB1 and Kv1.4 in nociceptive dorsal root ganglion neurons suggests a functional synergistic activity. Under the regulative control of CB1 the potassium channel as a mediator of an A-type potassium current can be involved in the control of repetitive discharges in the periphery and in the control of neurotransmitter release at the central terminals. From these findings starting points arise for the development of new drugs. With openers of Kv1.4 and/or cannabinoids which are effective peripherally the negative side effects of cannabinoids in the central nervous system could be avoided.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2560
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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