Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2546
Authors: Sattler, Ulrike
Title: Ein neues Lumineszenzverfahren zur quantitativen und räumlichen Darstellung von Produkten des Glukosestoffwechsels in Tumoren
Online publication date: 17-Mar-2008
Language: german
Abstract: Eine neue auf einer Pyruvat abhängigen Biolumineszenzreaktion basierende Methode zur quantitativen Bestimmung und räumlichen Darstellung von Pyruvat in Gefrierschnitten von Gewebeproben wurde entwickelt. Dabei wurden biochemische Reaktionen so verknüpft, dass sichtbares Licht proportional zum eingesetzten Pyruvatgehalt entstand. Eine hoch signifikante positive Korrelation beider Parameter ermöglichte eine Kalibrierung mit definierten Pyruvatgehalten und damit die Quantifizierung in unbekannten Proben. Die Nachweisgrenze lag bei 0,04 pmol Pyruvat mit einer Auflösung von 0,02 µmol/g. Das Biolumineszenzverfahren wurde mit Hilfe anderer Methoden validiert, wobei eine Wiederfindung mit einer konzentrationsabhängigen Abweichung von ≤ 15 % erzielt wurde. Ein wesentlicher Vorteil der neuen Methode gegenüber bisherigen Verfahren zum Pyruvatnachweis liegt in der Messwerterfassung definierter histologischer Gewebsareale. Dies wird durch computergesteuerte Überlagerung von Metabolitverteilungen mit Schnittbildern aus Strukturfärbungen und interaktiver, „optischer Mikrodissektion“ der Gewebeschnitte möglich. Ein weiterer Nutzen der Methode ist deren optionale Kombination mit der Biolumineszenztechnik für andere Stoffwechselprodukte. So ermöglicht eine exakte Superposition zweier Metabolitbilder von unmittelbar aufeinander folgenden Gewebeschnitten eine korrelative Kolokalisationsanalyse beider Metabolite. Das Ergebnis lässt sich zum einen in Form von „Pixel-zu-Pixel“-Korrelationen dokumentieren, zum anderen kann für jeden Bildpunkt ein Laktat/Pyruvat-Verhältnis als Maß für den Redoxzustand des Gewebes berechnet und dargestellt werden. Hieraus ergeben sich z.B. räumliche L/P-Verteilungen (L/P-Karten). Ein solches „Redoximaging“ durch Kartierung des L/ P-Quotienten ist bislang mit keinem anderen Verfahren möglich. Während die Entwicklung des Pyruvatnachweises eine Kernaufgabe der vorliegenden Arbeit darstellte, bestand ein weiterer wesentlicher Teil in der praktischen Anwendung der neuen Methode im Bereich der experimentellen Tumorforschung. So ergaben Messungen an acht verschiedenen Linien von humanen HNSCC-Xenotransplantaten (n = 70 Tumoren) einen mittleren Pyruvatgehalt von 1,24 ± 0,20 µmol/g. In sechs Humanbiopsien derselben Tumorentität wurde ein durchschnittlicher Pyruvatgehalt von 0,41 ± 0,09 µmol/g gemessen. Bei den Xenotransplantaten konnte eine signifikante positive Korrelation zwischen der Summe aus Laktat und Pyruvat bzw. dem L/P Verhältnis und der Strahlensensibilität gefunden werden, wobei das L/P-Verhältnis ebenso wie die Summe aus Laktat und Pyruvat maßgeblich von Laktat bestimmt wurden. Der Zusammenhang der Metabolite mit der Strahlensensibilität lässt sich durch deren antioxidative Eigenschaften erklären. Da der Redoxzustand der Zelle kritisch bezüglich der Effizienz von ROS induzierenden Therapieansätzen, wie z.B. Bestrahlung oder bestimmter Chemotherapeutika sein kann, könnte die Bestimmung des L/P Verhältnisses als prognostischer Faktor prädiktive Aussagen über die Sensibilität gegenüber solchen Behandlungen erlauben.
A novel bioluminescence assay has been developed for measuring pyruvate within sections of snapfrozen tissue in a quantitative manner as well as displaying the metabolite’s distribution within defined histological areas. Biochemical reactions were combined to induce emission of light which is proportional to the initial pyruvate concentration. A highly significant correlation between deployed pyruvate concentration and emitted light allowed for the detection of the pyruvate content in defined tissue regions following appropriate calibration. The minimal detectable amount was 0.04 pmol based on a 20 µm thick tissue section with an area of 1 cm2 with a resolution of 0.02 µmol/g. The bioluminescence approach was verified applying serveral independent assays. Based on the analysis of samples with given pyruvate concentrations, the novel bioluminescence assay exhibits a recovery with a deviation ≤ 15 %. A crucial benefit of the new method in contrast to previous methods is the possibility of data acquisition in defined histological areas. This is achieved by computerized overlay of metabolic distributions with images of histologically stained sections, i.e., by interactive “optical microdissection”. Another advantage of this method is its versatility in combination with the bioluminescence technique for detecting various other metabolites. Overlaying images of different metabolites that were assessed in consecutive tissue sections, allows for correlative colocalization analysis of metabolites, such as lactate and pyruvate. From this, pixel-to-pixel correlations may be generated between these metabolites. Furthermore, the redox state of tissues can be characterized by mapping lactate-to-pyruvate ratios (L/P ratios). Up to now, structure associated redox imaging by L/P ratio mapping has not been possible with other methods. The development of the pyruvate assay was a key task of the present thesis, but another important part was the practical application of the novel method in the field of experimental cancer research. Measurements in eight different lines of human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) xenografts (n = 70 tumors) revealed an average pyruvate content of 1.24 ± 0.20 µmol/g. Six human biopsies of the same tumor entity in patients showed an average of 0.41 ± 0.09 µmol/g pyruvate. The xenografts exhibited a significant positive correlation between the sum of pyruvate and lactate (L+P) or the L/P ratio and radiation response. Both L+P and L/P ratio were largely determined by variations in the respective lactate levels, whereas pyruvate was relatively invariant. Since the redox state of cancer cells can be critical for the efficiency of ROS-induced therapies, such as irradiation or a number of anticancer drugs, and since pyruvate and lactate are known to have radical scavenger functions, we hypothesize that the novel bioluminescence assay may be used for measuring the pretherapeutic L/P ratios which may predict the radiation response of individual malignancies.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2546
URN: urn:nbn:de:hebis:77-16038
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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