Identifizierung T-zellerkannter mutierter Neoantigene in einem humanen Melanommodell mittels Hochdurchsatzsequenzierung von Exomen und Transkriptomen
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Somatische Punktmutationen in Tumoren können zur Generierung von tumorspezifischen Neoantigenen führen, die von patienteneigenen T-Zellen erkannt werden. Nach solchen immunogenen Mutationen wurde im humanen Melanommodell Ma-Mel-86 durch Sequenzieren der Exome und Transkriptome von vier Tumorzelllinien und einer EBV-immortalisierten B-Zelllinie aus dem Blut der gleichen Patientin gesucht. Die Melanomzelllinien waren aus Lymphknotenmetastasen etabliert worden, die über einen Zeitraum von sechs Jahren aufgetreten waren, wobei bei den Zelllinien aus den zuletzt aufgetretenen Metastasen ein partieller bzw. vollständiger Verlust der Oberflächenexpression von HLA-Klasse I-Molekülen vorlag. Durch die Kombination der Daten beider Sequenzierverfahren und die Verwendung von parallel prozessierten Replikaten war es möglich, 181 exprimierte, nicht-synonyme, somatische Punktmutationen sicher zu identifizieren. Mithilfe der Algorithmen von NetMHC und der Immune Epitope Database (IEDB) wurden bei 80 ausgewählten Mutationen für die Bindung an HLA-Klasse I-Allele der Patientin insgesamt 174 Okta-, Nona- und Dekamere vorhergesagt und synthetisiert. Die Immunogenität der Peptidkandidaten wurde in IFNγ-ELISpot-Assays mit autologen MLTC (engl. mixed lymphocyte tumor cell culture)-Responderpopulationen aus Blutlymphozyten überprüft. Insgesamt erwiesen sich mit diesem Verfahren 5% (4/80) der getesteten Punktmutationen als immunogen. Die erkannten Peptide wurden von den punktmutierten Genen HERPUD1-G161S (engl. homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-likedomainmember1), INSIG1-S238F (engl.insulininducedgene1), MMS22L-S437F (engl. MMS22-like, DNA repair protein) und PRDM10-S1050F (engl. PR domain containing 10) kodiert. HERPUD1-G161S war bereits zuvor durch cDNA-Bank-Screening als ein durch HLA-B*15:01 restringiertes Neoantigen identifiziert worden. Die drei bisher unbekannten Neoantigene wurden mit mutationsspezifischen CD8+ T-Zellklonen weiter charakterisiert. Dabei wurden HLA-A*24:02 als gemeinsames Restriktionsmolekül bestimmt, die C-Termini der Peptide definiert und deren intrazelluläre Prozessierung bestätigt. Es zeigte sich, dass alle vier mutierten Neoantigene nur auf der Tumorzelllinie erkannt werden konnten, die aus der frühesten Metastase generiert worden war, da diese als einzige noch die restringierenden HLA-Klasse I-Allele exprimierte. Die dargestellten Ergebnisse erweitern das Spektrum bekannter mutierter Tumorantigene und zeigen eine Strategie auf zur raschen Identifizierung von immunologisch relevanten tumorspezifischen Mutationen mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung vorzugsweise im frühen Krankheitsverlauf.