Authors:	Schrörs, Barbara
Title:	Identifizierung T-zellerkannter mutierter Neoantigene in einem humanen Melanommodell mittels Hochdurchsatzsequenzierung von Exomen und Transkriptomen
Online publication date:	24-May-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Somatische Punktmutationen in Tumoren können zur Generierung von tumorspezifischen Neoantigenen führen, die von patienteneigenen T-Zellen erkannt werden. Nach solchen immunogenen Mutationen wurde im humanen Melanommodell Ma-Mel-86 durch Sequenzieren der Exome und Transkriptome von vier Tumorzelllinien und einer EBV-immortalisierten B-Zelllinie aus dem Blut der gleichen Patientin gesucht. Die Melanomzelllinien waren aus Lymphknotenmetastasen etabliert worden, die über einen Zeitraum von sechs Jahren aufgetreten waren, wobei bei den Zelllinien aus den zuletzt aufgetretenen Metastasen ein partieller bzw. vollständiger Verlust der Oberflächenexpression von HLA-Klasse I-Molekülen vorlag. Durch die Kombination der Daten beider Sequenzierverfahren und die Verwendung von parallel prozessierten Replikaten war es möglich, 181 exprimierte, nicht-synonyme, somatische Punktmutationen sicher zu identifizieren. Mithilfe der Algorithmen von NetMHC und der Immune Epitope Database (IEDB) wurden bei 80 ausgewählten Mutationen für die Bindung an HLA-Klasse I-Allele der Patientin insgesamt 174 Okta-, Nona- und Dekamere vorhergesagt und synthetisiert. Die Immunogenität der Peptidkandidaten wurde in IFNγ-ELISpot-Assays mit autologen MLTC (engl. mixed lymphocyte tumor cell culture)-Responderpopulationen aus Blutlymphozyten überprüft. Insgesamt erwiesen sich mit diesem Verfahren 5% (4/80) der getesteten Punktmutationen als immunogen. Die erkannten Peptide wurden von den punktmutierten Genen HERPUD1-G161S (engl. homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-likedomainmember1), INSIG1-S238F (engl.insulininducedgene1), MMS22L-S437F (engl. MMS22-like, DNA repair protein) und PRDM10-S1050F (engl. PR domain containing 10) kodiert. HERPUD1-G161S war bereits zuvor durch cDNA-Bank-Screening als ein durch HLA-B*15:01 restringiertes Neoantigen identifiziert worden. Die drei bisher unbekannten Neoantigene wurden mit mutationsspezifischen CD8+ T-Zellklonen weiter charakterisiert. Dabei wurden HLA-A*24:02 als gemeinsames Restriktionsmolekül bestimmt, die C-Termini der Peptide definiert und deren intrazelluläre Prozessierung bestätigt. Es zeigte sich, dass alle vier mutierten Neoantigene nur auf der Tumorzelllinie erkannt werden konnten, die aus der frühesten Metastase generiert worden war, da diese als einzige noch die restringierenden HLA-Klasse I-Allele exprimierte. Die dargestellten Ergebnisse erweitern das Spektrum bekannter mutierter Tumorantigene und zeigen eine Strategie auf zur raschen Identifizierung von immunologisch relevanten tumorspezifischen Mutationen mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung vorzugsweise im frühen Krankheitsverlauf. Somatic point mutations in tumors can lead to the generation of tumor-specific neoantigens which can be recognized by the patient’s own T cells. Such immunogenic mutations were searched for in the human melanoma model Ma-Mel-86 by whole exome and transcriptome sequencing of four tumor cell lines and an autologous EBV-transformed B cell line. The melanoma cell lines had been established from lymph node metastases occurring over six years. Tumor cell lines derived from the later occurring metastases completely or partially lacked cell surface expression of HLA class I molecules. Altogether 181 expressed non-synonymous somatic point mutations could be identified by combining the data from both sequencing procedures and by processing replicates in parallel. Using the NetMHC and the Immune Epitope Database (IEDB) algorithms, for 80 selected mutations 174 octa-, nona- and decamers were predicted to bind to the patient’s HLA class I alleles. The immunogenicity of these peptide candidates was tested in IFNγ ELISpot assays with MLTC (mixed lymphocyte tumor cell culture) responder populations derived from the patient’s blood lymphocytes. With this approach 5% (4/80) of the tested point mutations were found to be immunogenic. The recognized peptides were encoded by the point-mutated genes HERPUD1-G161S (homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1), INSIG1-S238F (insulin-induced gene 1), MMS22L-S437F (MMS22-like, DNA repair protein) and PRDM10-S1050F (PR domain containing 10). HERPUD1-G161S had been identified before as a neoantigen restricted by HLA-B*15:01 via cDNA expression screening. The three hitherto unknown neoantigens were further characterized with mutation-specific CD8+ T cell clones. HLA-A*24:02 was found to serve as a common restriction molecule. The C-termini of the peptides were defined and their intracellular processing was validated. It turned out that all four mutated neoantigens could only be recognized on the tumor cell line established first during the patient’s clinical course. It was the only tumor line in this model system that expressed all of the patient’s HLA class I alleles. These results broaden the spectrum of known mutated tumor antigens and involved a strategy based on high throughput sequencing which is suitable for the systematic identification of tumor-specific immunogenic mutations in due time preferably in an early disease phase.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2503
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000004997
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	164 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen