Authors:	Butzbach, Kathrin
Title:	Folat Rezeptor alpha vermittelte Aufnahme von Photosensibilisator-Konjugaten und die Phototoxizität der Folsäure
Online publication date:	28-Apr-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Ein aufstrebender Ansatz in der Tumortherapie ist die Photodynamische Therapie (PDT), bei der Photosensibilisatoren (PS) eingesetzt werden, die nach Bestrahlung zell- und gewebstoxische Moleküle, wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies (ROS), generieren. Für eine höhere Spezifität sollten Tumorzellen adressiert werden. Hierfür wurde ausgenutzt, dass viele Krebszellen den Folsäure-Rezeptor α (FRα) überexprimieren, der Folsäure (FS) und alles was daran gebunden ist endozytotisch in die Zelle aufnimmt. Zum Transport der PS wurden dabei hochmolekulare Vehikel verwendet, um bei späterer Anwendung den Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effekt ausnutzen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Transportsysteme charakterisiert: Im ersten System wurden Albumin-FS-Konjugate kovalent an geladene PS gebunden. Exemplarisch wurde hier mit β Carbolin Derivaten gearbeitet. Wir konnten zeigen, dass die kovalente Bindung von FS und einem PS an das Albumin zu einer FRα-spezifischen Aufnahme des gesamten Konstruktes in FRα-tragende KB Zellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses nach der endozytotischen Aufnahme in die Zellen ins Lysosom gelangt. Dort wird das Albumin abgebaut und setzt den PS frei. So konnte durch Bestrahlung eine hochspezifische Rezeptor-vermittelte Photozytotoxizität induziert werden, während das freie β Carbolin und ein Albumin β Carbolin-Konjugat ohne FS keinen zytotoxischen Effekt nach Bestrahlung zeigten. Durch Kompetition mit FS-Überschuss konnte dieser Effekt verhindert werden. Aufbauend auf den Ergebnissen, die mit den Albumin-FS-Konjugaten erhoben wurden, wurden FS-konjugierte Dextran-Partikel als weitere spezifische Transport-Vehikel charakterisiert. Sie sind in der Lage, große Mengen lipophiler PS einzuschließen. Hier wurde exemplarisch das Tetraphenylporphyrin (TPP) verwendet. Die hier verwendeten Dextran-Partikel sind säurelabil. Nach Aufnahme über den Rezeptor und Transport ins Lysosom fallen sie auseinander und geben den PS frei. Auch mit diesem System konnte eine hochspezifische FRα-vermittelte Photozytotoxizität gezeigt werden. Schon geringe Mengen (20 µg/mL) des FS-konjugierten und TPP beladenen Partikels führen nach kurzer Inkubationszeit und anschließender Bestrahlung zu vollständiger Zytotoxizität. Dieselben Partikel zeigten keinen Effekt im Dunkeln. Durch Kompetition mit einem Überschuss an FS kann der zytotoxische Effekt im untersuchten Konzentrationsbereich fast komplett aufgehoben werden. Dieselben Partikel ohne FS-Konjugation sind auf der Oberfläche kationisch geladen. Es wurde gefunden, dass diese Partikel lipophile PS hocheffizient, aber unspezifisch ins Zellinnere transportieren. Umgeht man hingegen die positive Ladung auf der Oberfläche der Partikel, wurden diese überhaupt nicht von Zellen aufgenommen und erwiesen sich deshalb trotz TPP-Beladung als vollkommen untoxisch. Während der Experimente zur FRα-vermittelten Aufnahme stießen wir als interessanten Nebenbefund auf das photozyto- und photogenotoxische Potential der FS selbst. Es konnte gezeigt werden, dass FS unter Bestrahlung zellfrei und in Zellen dosisabhängig oxidative DNA-Schäden generiert. Dieser Effekt konnte durch die Inhibition des FS-Metabolismus durch das Medikament Methotrexat (MTX) noch verstärkt werden. Außerdem wurde nach Inhibtion dieses Metabolismus ein signifikantes mutagenes Potential von FS plus Licht nachgewiesen. Dies liefert einen Anhaltspunkt, dass die bekannte kanzerogene Wirkung von UV-Licht nicht nur von dessen UV-B Anteil ausgelöst wird, sondern über endogene Chromophore, wie die FS und dessen Abkömmlingen, auch vom UV-A Anteil, verursacht wird. An interesting new way in tumor therapy is the photodynamic therapy (PDT). Photosensitizers (PS) are used to generate cell and tissue toxic molecules such as reactive oxygen species (ROS) under irradiation with light. To achieve higher specificity and efficiency it makes sense to address tumor cells via the folic acid receptor α (FRα) which is over expressed by many different tumors. FRα internalizes folic acid (FA) and everything that is bound to it endocyticly. For the transport of the PS we investigated two high molecular vehicles to take advantage of the Enhanced Permeability and Retention effect (EPR) later on in the treatment of cancer patients. The first characterized transport system in this thesis are albumin-FA-conjugates which are linked covalently to a charged PS. As an example we used β-carbolinium derivatives. We could show that the conjugate with FA is taken up specifically in FRα over expressing KB cells. Additionally, we could show that the conjugates are reaching the lysosome after endocytic uptake where the albumin gets degraded and the PS is released. On this way we could induce a highly FRα specific cytotoxicity after irradiation. At the same time the free β-carbolinium molecule and the conjugate without FA showed no light induced cytotoxicity at all. By using an excess of FA as competition on the receptor we could avoid the uptake and the following cytotoxicity nearly completely. Based on the results of the albumin conjugates we investigated FA linked dextran particles as a second possible transport system. They can incorporate big amounts of lipophilic PS. We used tetraphenylphorphyrin (TPP) generically. The used particles are acid-labile and fall apart after endocytic uptake and transport to the lysosome where they release their payload. With this transport system we could also show highly specific FRα mediated cytotoxicity. Very small amounts of the FA linked particles (20 µg/mL) showed complete light dependent cytotoxicity after short pre-incubation times. The same particles did not show any effect in the dark. The same particles without FA modification on the surface are positively charged. We found that they transport lipophilic PS even more efficient but not specific into cells. Avoiding the positive charge by using a different kind of dextran for the particle formation the TPP loaded particles showed no cytotoxic effect at all. During our experiments concerning FRα mediated uptake we came across the photocyto- and photogenotoxic potential of FA. We could show in this thesis that FA can induce oxidized DNA bases in cell-free DNA and in cells. This effect is both dose and light dependent. The inhibition of the FA metabolism by the drug Methotrexat (MTX) increases the intracellular effect significantly. Furthermore, we could show an increased mutation risk after MTX incubation and subsequent irradiation in presence of FA. This provides a clue that the cancerogenous effect of UV light is not only caused by the UV-B fraction, but also by UV-A in combination with endogenous chromophores such as FA.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2492
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000004213
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	128 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen