Authors:	Jehn, Julia
Title:	Small RNA Pathways – Exploration of new players, supposedly lost sites of action and an unperceived defense strategy
Online publication date:	25-Nov-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Seit ihrer Entdeckung in den 90er Jahren wurden die Wirkungsmechanismen kleiner RNAs intensiv untersucht, wodurch ein komplexes Geflecht aus interagierenden Mechanismen und Organismus-spezifischen Anpassungen erkennbar wurde. Dennoch konzentrieren sich die meisten Studien auf die vermeintlich kanonischen Funktionen der drei großen kleinen RNA-Klassen (miRNAs, siRNAs und piRNAs). Ziel dieser Dissertation ist es verschiedene unerforschte Aspekte kleiner RNA-Pathways zu beleuchten. Zunächst werden neue Akteure im Universum der kleinen RNAs untersucht: tRNA-Fragmente (tRFs). In Kapitel 1 wird der aktuelle Wissensstand über tRFs dargestellt. In Kapitel 2 werden öffentlich verfügbare und eigene Sequenzierungsdaten kleiner RNAs analysiert, um einen ersten Überblick über die Expression von tRFs in verschiedenen Geweben und Arten zu geben. Diese Analysen deuten darauf hin, dass ein hohes Level an 5' tRNA-Hälften (5' tRHs) ein spezifisches Merkmal des Hippocampus von Primaten ist. Durch Modulation der Regulationskapazität ausgewählter 5' tRHs in HEK293T- und HepG2-Zellen und anschließender Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten werden potenzielle Ziel-Transkripte identifiziert, welche zum Teil eine Rolle in der Neurogenese spielen. Darüber hinaus wird ein neuartiger k-mer-Ansatz verwendet, um die Targeting-Regel ausgewählter 5' tRHs zu identifizieren. Diese Analysen deuten darauf hin, dass anstelle eines miRNA-ähnlichen 5'-seeds eher der mittlere Teil der 5' tRHs für ein effektives Silencing wichtig ist. Darüber hinaus wird der in der Keimbahn von Tieren gut erforschte piRNA-Pathway in dem bislang vernachlässigten Soma untersucht. In Kapitel 3 wird das PIWI-Repertoire und die Expression der jeweiligen PIWI Paraloge in der Keimbahn und in somatischen Geweben von Weichtieren analysiert. Exemplarisch für die Spitzschlammschnecke und die pazifische Auster wird gezeigt, dass PIWI-Proteine in somatischen Geweben flächendeckend exprimiert werden, was vergleichbare, in Arthropoden gewonnen Erkenntnisse bestärkt. Dies deutet darauf hin, dass ein funktioneller somatischer piRNA-Pathway der Ur-Zustand von Protostomen ist und nicht eine Besonderheit bestimmter Taxa. Die putativen piRNAs und piRNA-Cluster verschiedener Entwicklungsstadien werden zudem charakterisiert. Angesichts fehlender Antikörper gegen PIWI-Proteine, um potenzielle somatische piRNAs kopräzipitieren zu können, wird in Kapitel 4 ein neuartiger RNAi-basierter Ansatz beschrieben, um kleiner RNAs zu identifizieren, deren Expression von PLD6 abhängt. PLD6 ist eine Endonuklease, die unabdinglich für die Produktion von primären piRNAs in der tierischen Keimbahn ist. Zuletzt wird eine mögliche, bisher unbekannte Strategie von einzelsträngigen RNA-Viren, kleinen RNA-basierten Abwehrmechanismen des Wirtes zu entkommen beschrieben, die durch die in Kapitel 5 beschriebenen Analysen der Dimension der strukturellen Selektion von protein-kodierenden Sequenzen offenbart wird. Da insbesondere bei einzelsträngigen RNA-Viren extreme Sekundärstrukturen von kodierende Sequenzen häufiger als erwartet auftreten, wird vermutet, dass sich die viralen Genome zugunsten hochgefalteter Transkripte entwickelt haben, um dem RNAi-System des Wirtes weniger Angriffsfläche zu bieten. Since their discovery in the 1990s, small RNA pathways were intensively studied unravelling a complex mesh of interacting mechanisms and organism-specific adaptations. Still, most studies concentrate on the alleged canonical functions of the three major small RNA classes (miRNAs, siRNAs and piRNAs). This thesis aims to tackle various unexplored aspects of small RNA pathways. First, the new players in the small RNA universe, the tRNA fragments (tRFs), are investigated. In chapter 1, the current knowledge on tRFs (in the review named tRNA-derived small RNAs; tsRNAs) is reviewed. In chapter 2, publicly available and own small RNA sequencing data is analyzed to give an initial overview on tRF expression across various tissues and species. These analyses indicate that high levels of 5’ tRNA-halves (5’ tRHs) are a specific trait of the primate hippocampus. By modulating the regulation capacity of selected 5’ tRHs in HEK293T and HepG2 cells and subsequent RNA sequencing analyses, potential target transcripts are identified which in part seem to be implicated in neurogenesis. Furthermore, a novel k-mer approach is used to dissect the targeting rule of selected 5’ tRHs, indicating that instead of a miRNA-like 5’ seed rather the middle part of 5’ tRHs is important for effective silencing. Second, the piRNA pathway, which is well studied in the germline of animals, is examined in the previously neglected soma. In chapter 3, the PIWI repertoire and expression is investigated in the germline and somatic tissues of two representative mollusks (the great pond snail and the pacific oyster) showing that PIWI proteins are ubiquitously expressed in the soma. Reinforcing analogous findings made for arthropods, this suggests that a functional somatic piRNA pathway is the ancestral state of protostomes and not a peculiarity of certain taxa. Furthermore, lineage-specific adaptations of piRNA targets and a dynamic expression of piRNA cluster during different developmental stages are shown. Faced with the non-availability of adequate antibodies against PIWI proteins to co-immunoprecipitate potential somatic piRNAs, in chapter 4, a novel RNAi-based approach is described in order to identify small RNAs whose expression depend on Phospholipase D family member 6 (PLD6), an endonuclease that is critical for the production of primary piRNAs in the animal germline. Third, a previously unperceived strategy of single-stranded RNA viruses to evade small RNA-based defense mechanisms of the host is revealed by studying the dimension of structural selection of coding sequences, which is described in chapter 5. As especially for single-stranded RNA viruses extreme secondary structures of coding sequences are found to occur more often than expected by chance, it is suspected that viral genomes evolved in favor of highly folded transcripts in order to be less attackable for the host’s RNAi system.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2380
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000031796
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IV, 147 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen