Small RNA Pathways – Exploration of new players, supposedly lost sites of action and an unperceived defense strategy
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Abstract
Seit ihrer Entdeckung in den 90er Jahren wurden die Wirkungsmechanismen kleiner RNAs intensiv untersucht, wodurch ein komplexes Geflecht aus interagierenden Mechanismen und Organismus-spezifischen Anpassungen erkennbar wurde. Dennoch konzentrieren sich die meisten Studien auf die vermeintlich kanonischen Funktionen der drei großen kleinen RNA-Klassen (miRNAs, siRNAs und piRNAs). Ziel dieser Dissertation ist es verschiedene unerforschte Aspekte kleiner RNA-Pathways zu beleuchten.
Zunächst werden neue Akteure im Universum der kleinen RNAs untersucht: tRNA-Fragmente (tRFs). In Kapitel 1 wird der aktuelle Wissensstand über tRFs dargestellt. In Kapitel 2 werden öffentlich verfügbare und eigene Sequenzierungsdaten kleiner RNAs analysiert, um einen ersten Überblick über die Expression von tRFs in verschiedenen Geweben und Arten zu geben. Diese Analysen deuten darauf hin, dass ein hohes Level an 5' tRNA-Hälften (5' tRHs) ein spezifisches Merkmal des Hippocampus von Primaten ist. Durch Modulation der Regulationskapazität ausgewählter 5' tRHs in HEK293T- und HepG2-Zellen und anschließender Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten werden potenzielle Ziel-Transkripte identifiziert, welche zum Teil eine Rolle in der Neurogenese spielen. Darüber hinaus wird ein neuartiger k-mer-Ansatz verwendet, um die Targeting-Regel ausgewählter 5' tRHs zu identifizieren. Diese Analysen deuten darauf hin, dass anstelle eines miRNA-ähnlichen 5'-seeds eher der mittlere Teil der 5' tRHs für ein effektives Silencing wichtig ist.
Darüber hinaus wird der in der Keimbahn von Tieren gut erforschte piRNA-Pathway in dem bislang vernachlässigten Soma untersucht. In Kapitel 3 wird das PIWI-Repertoire und die Expression der jeweiligen PIWI Paraloge in der Keimbahn und in somatischen Geweben von Weichtieren analysiert. Exemplarisch für die Spitzschlammschnecke und die pazifische Auster wird gezeigt, dass PIWI-Proteine in somatischen Geweben flächendeckend exprimiert werden, was vergleichbare, in Arthropoden gewonnen Erkenntnisse bestärkt. Dies deutet darauf hin, dass ein funktioneller somatischer piRNA-Pathway der Ur-Zustand von Protostomen ist und nicht eine Besonderheit bestimmter Taxa. Die putativen piRNAs und piRNA-Cluster verschiedener Entwicklungsstadien werden zudem charakterisiert. Angesichts fehlender Antikörper gegen PIWI-Proteine, um potenzielle somatische piRNAs kopräzipitieren zu können, wird in Kapitel 4 ein neuartiger RNAi-basierter Ansatz beschrieben, um kleiner RNAs zu identifizieren, deren Expression von PLD6 abhängt. PLD6 ist eine Endonuklease, die unabdinglich für die Produktion von primären piRNAs in der tierischen Keimbahn ist.
Zuletzt wird eine mögliche, bisher unbekannte Strategie von einzelsträngigen RNA-Viren, kleinen RNA-basierten Abwehrmechanismen des Wirtes zu entkommen beschrieben, die durch die in Kapitel 5 beschriebenen Analysen der Dimension der strukturellen Selektion von protein-kodierenden Sequenzen offenbart wird. Da insbesondere bei einzelsträngigen RNA-Viren extreme Sekundärstrukturen von kodierende Sequenzen häufiger als erwartet auftreten, wird vermutet, dass sich die viralen Genome zugunsten hochgefalteter Transkripte entwickelt haben, um dem RNAi-System des Wirtes weniger Angriffsfläche zu bieten.