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Authors: Galante, Chiara
Title: Factors determining competence for in vivo glia-to-neuron conversion
Online publication date: 14-Nov-2019
Language: english
Abstract: In vivo glia-to-neuron conversion mediated by transcription factors is emerging as a possible cell replacement strategy to respecify brain resident cells into lost neuronal cell types and to reinstate the function of disrupted circuitries in the presence of injury, neuropsychiatric disorders or other insults. Different factors, such as the absence or presence of injury, the cell type of origin and the choice of transcription factors influence the ability to convert cortical glia into neurons in vivo. However, the role that post-translational modification of transcription factors or the intrinsic heterogeneity of the starting cell population have in this process is largely unknown. In this thesis, I show that the ability of the proneural transcription factor ASCL1 to direct cell fate-switch in proliferative postnatal cortical glia is increased by the lack of protein phosphorylation. I found that, in postnatal cortical astrocytes cultures transduced with retroviruses encoding for three forms of ASCL1 differing in their phosphorylation states, the induction of a phospho-deficient mutant leads to increased reprogramming efficiency compared to the wild type protein or a phospho-mimetic mutant. However, independently on its phosphorylation state, ASCL1 is not able to efficiently convert postnatal cortical glia into neurons in vivo but rather decreases the proportion of astroglia favouring generation of oligodendroglia. The exogenous expression of both phospho-mutants leads to an increase in mature oligodendrocytes, consistent with a role of Ascl1 in the differentiation of oligodendrocyte progenitors. Moreover, I demonstrated that co-transduction of Bcl2 with Ascl1 successfully induces glia-to-neuron conversion. Remarkably, when associated with Bcl2, both phospho-mutants showed a greater neurogenic ability compared to the wild type protein and the phospho-deficient mutant drove the formation of a higher proportion of NeuN-expressing neurons. In summary, while the phosphorylation state of ASCL1 does not seem to promote cell fate-switch per se, it influences the maturation level of reprogrammed postnatal cortical glia and the conversion efficiency in association with BCL2. Furthermore, I describe an adaptation of a clonal labelling system, called StarTrack, for in vivo cortical astrocyte-to-neuron conversion and, eventually, clonal analysis of induced neurons. Here, I illustrate the results obtained from preliminary experiments in which the tamoxifen-activated proneural factors ASCL1ERT2 and NEUROG2ERT2 are induced in GFAP-expressing postnatal cortical astrocytes. These experiments revealed the limitations of the system, such as insufficient expression levels of the plasmids expressing Ascl1ERT2 and Neurog2ERT2 and the failure to induce formation of DCX-positive neurons to date. After identification of the pitfalls of the system, I describe a possible strategy to circumvent them. In the future, coupling tamoxifen-inducible activation of forced neurogenesis in astrocytes with clonal labelling of converted cells will permit the identification of the glial clones from which induced neurons are generated and, conversely, identification of the astrocytic populations that expressed the proneural factors but failed to reprogram. Together, understanding the mechanisms favouring the execution of neurogenic programs instructed by transcription factors and the reasons, why some glial subpopulations fail to erase their original fate and switch lineage, will help developing strategies to improve cell fate conversion for regenerative medicine.
Die Transkriptionsfaktor-vermittelte in vivo Glia-zu-Neuron Umwandlung, ist eine neu aufkommende, mögliche Zellersatz-Strategie um residente Zellen im Gehirn Zellen in verloren gegangene neuronale Zelltypen umzuwandeln und die Funktion angesichts von Verletzungen, neuropsychatrischer Krankheiten und weiterer Insulte unterbrochener Verschaltungen wiederherzustellen. Verschiedene Faktoren, wie z.B. das Vorhandensein oder Fehlen von Verletzungen, der Ursprungszelltyp und die Wahl der Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Fähigkeit, kortikale Glia in vivo in Neuronen umzuwandeln. Die Rolle, die die post-translationale Modifikation von Transkriptionsfaktoren oder die intrinsische Heterogenität der Ausgangszellpopulation bei diesem Prozess spielen, ist allerdings weitestgehend unbekannt. In dieser Arbeit zeige ich, dass die Fähigkeit des proneuralen transkriptionsfaktors ASCL1 den Wechsel des Zellschicksals proliferativer postnataler kortikaler Glia zu dirigieren, durch das Fehlen der Proteinphosphorylierung erhöht wird. In postnatalen kortikalen Astrozytenkulturen, die durch Retrovieren mit verschiedenen Formen von ASCL transduziert werden, welche sich in ihrem Phosphorylierungsstatus unterscheiden, konnte ich feststellen, dass die Induktion einer phospho-defizienten Mutante, im Vergleich zum Wilttyp Protein oder einer phospho-mimetischen Mutante, zu einer erhöhten Reprogrammierungseffizienz führt. Unabhängig von seinem Phosphorylierungsstatus, ist ASCL1 jedoch nicht in der Lage, postnatale kortikale Glia in vivo effizient in Neuronen zu konvertieren. Vielmehr verringert es den Anteil an Astroglia, die die Bildung von Oligodendroglia begünstigen. Im Einklang mit der Rolle von Ascl1 bei der Differnzierung von Oligodendrozyten-Vorläufern, führt die exogene Expression beider Phosphomutanten zu einem Anstieg reifer Oligodendrozyten. Darüberhinaus konnte ich zeigen, dass die Co-Transduktion von Bcl2 mit Ascl1 erfolgreich eine Glia-zu-Neuron Umwandlung induziert. Bemerkenswerterweise zeigten beide Phosphomutanten in Verbindung mit Bcl2 eine erhöhte Neurogenität im Vergleich zum Wildtypprotein, die phosphodefiziente Mutante führte zu einer anteilig vermehrten Bildung NeuN-exprimieremder Neuronen. Zusammenfassend kann man sagen, dass, obwohl der Phosphorylierungsstatus von ASL1 per se keinen Zellschicksal-Wechsel zu fördern scheint, es in Verbindung mit BCL2 dennoch den Reifegrad reprogrammierter postnataler kortikaler Glia und die Umwandlungseffizienz beinflusst. Des weiteren beschreibe ich die Anpassung eines klonalen Kennzeichnungssystems namens StarTrack zur in vivo Astrozyt-zu-Neuron Umwandlung und letzendlich klonalen Analyse induzierter Neuronen. Hier verdeutliche ich Ergebnisse aus Vorversuchen, in welchen die Tamoxifen-aktivierten proneuralen Faktoren ASCL1ERT2 und NEUROG2ERT2 in GFAP-exprimierenden postnatalen kortikalen Astrozyten induziert werden. Diese Experimente zeigten die sogenannten „Stolperfallen“ des Systems auf, wie z.B. unzureichende Expressionslevel der Ascl1ERT2 und Neurog2ERT2 exprimierenden Plasmide und die bis heute erfolglosen Versuche die Formation DCX-positiver Neuronen zu Induzieren. Nach Identifikation dieser Hindernisse im System, gehe ich weiterhin auf mögliche Strategien ein um diese zu verhindern. Die Kopplung von Tamoxifen-induzierbarer Aktivierung forcierter Neurogenese von Astozyten mit der klonalen Markierung umgewandelter Zellen wird es erlauben, gliale Klone zu identifizieren, aus denen Neuronen gebildet werden können. Umgekehrt wird auch die Identifikation astrozytischer Population welche zwar proneurale Faktoren exprimieren jedoch nicht umprogrammiert wurden möglich. Das Verständnis der Mechanismen, die die Ausführung Transkriptionsfaktor-angewiesener neurogener Programme begünstigen, wie auch der Gründe, warum manche gliale Subpopulationen nicht in der Lage sind ihr Ursprungsschicksal zu überschreiben und ihre Abstammungs-/Entwicklungslinie zu wechseln, wird in Zukunft dabei helfen, neue Strategien zu entwickeln um die Umwandlung des Zellschicksals für die regenerative Medizin zu verbessern.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2366
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: VI, 150 Blätter
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