Authors:	Bogucka, Katarzyna
Title:	Role of ERK3 in the regulation of IL-8 and epithelial secretome-mediated chemotaxis
Online publication date:	24-Oct-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Extracellular signal-regulated kinase 3 (ERK3) is a member of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and along with ERK4 and MK5 constitutes one of the less understood atypical MAPK modules. Recently, ERK3 gained due attention for its role in mediating tumor cell migration and metastasis. As the molecular mechanisms regulating ERK3 expression and function are unclear, the aim of this study is to decipher the activation dynamics and functional significance of this atypical MAPK. In this study, we primarily aimed to evaluate the role of ERK3 in regulating innate immune responses. Loss of function studies revealed a critical role of ERK3 in the control of LPS-regulated gene expression in epithelial cells. During the course of this study, we detected that CXCL8/IL-8 expression is strictly reliant on the expression of ERK3 in human colonic primary epithelial cells as well as in cancer cell lines. ERK3 controls IL-8 production and secretion in a kinase independent manner. It was further characterized that IL-8 promoter activity is dependent on ERK3 and several known transcription factors that control IL-8 expression are regulated by ERK3. Moreover, ERK3 plays a critical role in AP-1 signaling by interacting with and regulating nuclear localization of c-Jun protein in response to LPS. Furthermore, ERK3 also regulates MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1), GCP-2 (Granulocyte chemotactic protein-2) or CXCL10, which are critically required for maintaining proper epithelial secretome and leukocytes chemotaxis in vitro and in vivo. We also detect that LPS elicits differential effects on ERK3 protein stability in a cell type dependent manner. Whilst in primary cells, LPS stimulation induced rapid ubiquitination and proteasomal degradation of ERK3, LPS seems to stabilize levels of ERK3 by blocking its proteasomal degradation in HT-29 cells. However, the IL-8 levels correlate to the expression of ERK3 irrespective of the cell types. Blocking of the proteasomal degradation led to an accumulation of ERK3 protein and consequently rescued IL-8 levels regardless of the inhibition of MEK1/2-ERK1/2 pathway. Most importantly, loss of ERK3 levels led to a strong reduction in IL-8 levels despite the inhibition of the classical MAPK cascades or activation of NF-κB. In addition, MK5 and ERK4 exhibit opposing effects on ERK3 levels. While the well-studied ERK1/2, p38, JNK and NF-κB pathways are reported as the main regulating pathways controlling IL-8 expression, this study unveiled a obligatory and yet synergistic role for ERK3 in the regulation of epithelial secretome, including IL-8. The study further demonstrated that the secretome of ERK3 depleted cells failed to promote leukocyte chemotaxis both in vitro and in vivo, suggesting a critical role for this atypical MAPK in the maintenance of epithelial secretome. ERK3 has been shown to be required for the maintenance of epithelial architecture and some of the observations made here may possibly contribute to this phenotype. Further, as IL-8 has been shown to play a pivotal role in tumourigenesis and metastasis, attempts could be made to target ERK3 in these settings. Taken together, the body of the work presented here unveils a critical role for this atypical MAPK in the regulation of epithelial secretome and leukocyte chemotaxis. Extracellular-signal regulated kinase 3 (ERK3) gehört zu der Familie der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) und zusammen mit ERK4 und MK5 bildet ERK3 die Gruppe der noch wenig untersuchten atypischen MAPK. Kürzlich wurde die Rolle von ERK3 in Tumorzellmigration und Metastasierung beschrieben. Über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Regulation sowie die Funktion von ERK3 ist bislang nur wenig bekannt. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die Aktivierung sowie die funktionelle Bedeutung der atypischen MAPK näher zu untersuchen. Hierbei lag der Fokus auf der Rolle von ERK3 in der Regulation des angeborenen Immunsystems. Der Verlust von ERK3 in Epithelzellen führte zu Veränderungen in der LPS-vermittelten Genexpression und legt somit eine entscheidende Rolle dieses Faktors nahe. Im Verlauf unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die CXCL8/IL-8 Expression strikt über die Expression von ERK3 in primären Kolonepithelzellen und weiteren Tumorzelllinien reguliert wird. Interessanterweise kontrolliert ERK3 die IL-8 Produktion und Sekretion unabhängig von seiner Kinaseaktivität. Darüberhinaus kontrolliert ERK3 direkt die IL-8 Promotoraktivität sowie die Aktivität zahlreicher weiterer Transkriptionsfaktoren, die in der IL-8 Expression und Sekretion von Bedeutung sind. Darüberhinaus spielt ERK3 eine wesentliche Rolle in der AP-1 vermittelten Signalweiterleitung: Nach LPS Stimulation interagiert ERK3 mit c-Jun und reguliert dessen Translokation in den Nukleus. Neben IL-8, reguliert ERK3 ebenfalls die Expression von weiteren Chemokinen wie MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1), GCP-2 (Granulocyte chemotactic protein-2) und CXCL10. Diese Chemokine sind zum einen für die Zusammensetzung des epithelialen Sekretoms mit verantwortlich und zum anderen spielen sie in der Chemotaxis von Leukozyten in vitro und in vivo eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass LPS Zelltyp-abhängige Effekte auf die ERK3 Proteinstabilität hat: Während in primären Zellen eine LPS Stimulation eine schnelle Ubiquitinierung und den Abbau von ERK3 durch das Proteasom induzierte, löste die LPS Stimulation in HT-29 Zellen eine Blockade des Proteasoms aus, was letzlich zu einer Stabilisierung des ERK3 Proteins führte. Hierbei korrelierte die Expression von IL-8 mit der von ERK3. Eine Inhibierung des Proteasoms führte dies zu einer Akkumulierung von ERK3 Protein, wodurch die IL-8 Level ebenfalls aufrecht erhalten wurden. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls erzielt, wenn der MEK-ERK1/2 Signalweg blockiert wurde. Von großer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass der Verlust von ERK3 die IL-8 Level drastisch senkte. Die Blockade der klassischen MAPK Signalkaskaden oder die Aktivierung von NFkappaB führte zu keinen anderen Ergebnissen. Zusätzlich zeigte sich, dass MK5 und ERK4 gegensätzliche Effekte auf das ERK3 Expressionslevel ausüben. Während der regulatorische Effekt von ERK1/2, p38, JNK und NF-κB induzierten SIgnalwegen auf die IL-8 Expression bereits bekannt war, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ERK3 eine wesentliche Rolle im Sekretom von Epithelzellen spielt und hierbei zwingend erforderlich ist jedoch synergistisch wirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass das Sekretom ERK3 depletierter Zellen nicht in der Lage ist die Chemotaxis von Leukozyten in vitro und in vivo zu unterstützen, wodurch dieser atypischen MAPK eine essentielle Rolle in der Zusammensetzung des Sekretoms von Epithelzellen zugesprochen werden kann. In der Literatur wurde bereits beschrieben, dass ERK3 wesentlich zum Erhalt epithelialer Strukturen beiträgt. Einige Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen dies. Darüberhinaus ist bekannt, dass IL-8 eine Schlüsselrolle in der Tumorigenese und Metastasierung spielt. Daher könnte ERK3 eine valide Zielstruktur sein, um neue therapeutische Ansätze zu entwickeln. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass atypische Kinasen wie ERK3 eine entscheidende Rolle in der Regulation des epithelialen Sekretoms und der Chemotaxis von Leukozyten haben.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2348
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000031310
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	115 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen