Identifikation und Charakterisierung immunogener Leishmania major-spezifischer Proteine als potentielle Vakzinkandidaten gegen die kutane Leishmaniasis

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Infektionen mit Leishmania spp. stellen in über 90 Ländern weltweit ein schwerwiegendes Problem dar. Die Zahl der Todesopfer liegt bei etwa 30.000 pro Jahr und ist überwiegend auf betroffene Individuen mit einer Immunsuppression oder Ko-Infektion zurückzuführen. Bisher existiert keine effektive Vakzine gegen die humane kutane Leishmaniasis (CL). Ihre Entwicklung sollte jedoch möglich sein, da immunkompetente Individuen nach einer ausgeheilten Primärinfektion gegen eine Re-Infektion mit derselben Leishmania-Subspezies resistent sind. Die Heilung basiert auf der Freisetzung von Th1/Tc1-assoziiertem IFNγ. Für die Identifikation immunogener Proteine, die als potentielle Vakzinkandidaten gegen die CL in Betracht gezogen werden können, wurde stark immunogenes L. major Lysat (lösliche Leishmanien Antigene, SLA) zunächst mittels differentieller Zentrifugation in seine Bestandteile aufgetrennt. Zur Untersuchung der protektiven Kapazität isolierter löslicher Proteine (SP) in vivo wurden C57BL/6 Mäuse mit unterschiedlichen Proteinmengen (von 10 ng bis 100 µg) in Kombination mit CpG als Adjuvanz 3x intradermal in ein Ohr immunisiert. Die physiologisch relevante Niedrigdosis-Infektion mit lebenden metazyklischen L. major Promastigoten wurde in das kontralaterale Ohr injiziert. Es zeigte sich ein stark Dosis-abhängiger schützender Effekt der SP in vivo, der mit der Entwicklung unterschiedlicher Läsionsvolumina einherging. Im Gegensatz zu nicht geschützten CpG-Kontrollmäusen induzierte die Immunisierung mit 1 µg SP + CpG die Antigen-spezifische Proliferation von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen in vitro. Demzufolge scheinen SP hochpotente Komponenten zu beinhalten, welche die Ausbildung effektiver Immunreaktionen gegen L. major Infektionen fördern. Zur Identifikation und Charakterisierung einzelner immunogener Antigene aus SP erfolgte die Fraktionierung von SP in zwei Schritten mittels Anionenaustauscherchromatographie. Eluierte Fraktionen wurden in vitro in einem Restimulationsassay mit dLK-Zellen aus L. major-infizierten C57BL/6 Mäusen getestet. Nach Restimulation mit SP zeigte sich ein dominantes Th1/Tc1-Zytokinprofil, das vergleichbar war mit dem nach Antigen-spezifischer SLA-Stimulation. Es wurden einzelne reaktive Fraktionen des SP gefunden, die im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollen in vitro hohe IFNγ-Levels induzierten. Die Identifikation von insgesamt 36 L. major-spezifischen Proteinen erfolgte mittels quantitativer Massenspektrometrie in reaktiven Fraktionen. Dem detektierten Proteingehalt entsprechend und in Korrelation mit der Fraktions-spezifischen Kapazität, hohe IFNγ-Levels zu induzieren, wurden 4 Proteinkandidaten (Protein A, C, D und E) für weitere Analysen ausgewählt. Die rekombinant exprimierten Proteine A, C bzw. E zeigten immunogenes Potential, in dem sie in vitro die Aktivierung und Proliferation von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen induzierten. Es folgte die Untersuchung ihrer schützenden Kapazität in vivo mit unterschiedlichen Proteindosen. Interessanterweise waren nur die mit Protein C behandelten Mäuse gegen die L. major Infektion geschützt. Diese Tiere zeigten im Gegensatz zu den anderen Gruppen nahezu keine Läsionsentwicklung. Nach Behandlung mit CpG, SP, Protein A oder Protein C (jeweils 1 µg kombiniert mit CpG) waren in Woche 6 nach Infektion keine Unterschiede in den Parasitenlasten der Ohren aller Gruppen sichtbar. Die intrazelluläre Produktion des Th1-induzierenden Transkriptionsfaktors T-bet sowie des Th1-spezifischen Zytokins IFNγ war in den geschützten Mäusen nach SP + CpG- oder Protein C + CpG-Immunisierung jedoch geringer. Eine initiale Immunisierung suszeptibler BALB/c Mäuse mit den Proteinkandidaten war sehr vielversprechend. Alle Gruppen, die mit SP, Protein C oder E (jeweils 1 µg + CpG) behandelt worden waren, entwickelten nach der Infektion nahezu keine Ohrläsionen. Im Gegensatz dazu musste der Versuch der mit Protein D + CpG oder CpG allein behandelten Mäuse frühzeitig aufgrund eines progressiven Krankheitsverlaufs beendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das erstmals identifizierte Protein C eine potentielle Quelle für protektive T-Zell-Epitope gegen L. major Parasiten gleichermaßen für sowohl resistente als auch empfindliche Mäuse darstellt und damit maßgeblich zu der Entwicklung einer Vakzine gegen die CL beitragen könnte.

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