Authors:	Schermann, Anja Ingrid
Title:	Identifikation und Charakterisierung immunogener Leishmania major-spezifischer Proteine als potentielle Vakzinkandidaten gegen die kutane Leishmaniasis
Online publication date:	8-Oct-2019
Year of first publication:	2019
Language:	german
Abstract:	Infektionen mit Leishmania spp. stellen in über 90 Ländern weltweit ein schwerwiegendes Problem dar. Die Zahl der Todesopfer liegt bei etwa 30.000 pro Jahr und ist überwiegend auf betroffene Individuen mit einer Immunsuppression oder Ko-Infektion zurückzuführen. Bisher existiert keine effektive Vakzine gegen die humane kutane Leishmaniasis (CL). Ihre Entwicklung sollte jedoch möglich sein, da immunkompetente Individuen nach einer ausgeheilten Primärinfektion gegen eine Re-Infektion mit derselben Leishmania-Subspezies resistent sind. Die Heilung basiert auf der Freisetzung von Th1/Tc1-assoziiertem IFNγ. Für die Identifikation immunogener Proteine, die als potentielle Vakzinkandidaten gegen die CL in Betracht gezogen werden können, wurde stark immunogenes L. major Lysat (lösliche Leishmanien Antigene, SLA) zunächst mittels differentieller Zentrifugation in seine Bestandteile aufgetrennt. Zur Untersuchung der protektiven Kapazität isolierter löslicher Proteine (SP) in vivo wurden C57BL/6 Mäuse mit unterschiedlichen Proteinmengen (von 10 ng bis 100 µg) in Kombination mit CpG als Adjuvanz 3x intradermal in ein Ohr immunisiert. Die physiologisch relevante Niedrigdosis-Infektion mit lebenden metazyklischen L. major Promastigoten wurde in das kontralaterale Ohr injiziert. Es zeigte sich ein stark Dosis-abhängiger schützender Effekt der SP in vivo, der mit der Entwicklung unterschiedlicher Läsionsvolumina einherging. Im Gegensatz zu nicht geschützten CpG-Kontrollmäusen induzierte die Immunisierung mit 1 µg SP + CpG die Antigen-spezifische Proliferation von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen in vitro. Demzufolge scheinen SP hochpotente Komponenten zu beinhalten, welche die Ausbildung effektiver Immunreaktionen gegen L. major Infektionen fördern. Zur Identifikation und Charakterisierung einzelner immunogener Antigene aus SP erfolgte die Fraktionierung von SP in zwei Schritten mittels Anionenaustauscherchromatographie. Eluierte Fraktionen wurden in vitro in einem Restimulationsassay mit dLK-Zellen aus L. major-infizierten C57BL/6 Mäusen getestet. Nach Restimulation mit SP zeigte sich ein dominantes Th1/Tc1-Zytokinprofil, das vergleichbar war mit dem nach Antigen-spezifischer SLA-Stimulation. Es wurden einzelne reaktive Fraktionen des SP gefunden, die im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollen in vitro hohe IFNγ-Levels induzierten. Die Identifikation von insgesamt 36 L. major-spezifischen Proteinen erfolgte mittels quantitativer Massenspektrometrie in reaktiven Fraktionen. Dem detektierten Proteingehalt entsprechend und in Korrelation mit der Fraktions-spezifischen Kapazität, hohe IFNγ-Levels zu induzieren, wurden 4 Proteinkandidaten (Protein A, C, D und E) für weitere Analysen ausgewählt. Die rekombinant exprimierten Proteine A, C bzw. E zeigten immunogenes Potential, in dem sie in vitro die Aktivierung und Proliferation von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen induzierten. Es folgte die Untersuchung ihrer schützenden Kapazität in vivo mit unterschiedlichen Proteindosen. Interessanterweise waren nur die mit Protein C behandelten Mäuse gegen die L. major Infektion geschützt. Diese Tiere zeigten im Gegensatz zu den anderen Gruppen nahezu keine Läsionsentwicklung. Nach Behandlung mit CpG, SP, Protein A oder Protein C (jeweils 1 µg kombiniert mit CpG) waren in Woche 6 nach Infektion keine Unterschiede in den Parasitenlasten der Ohren aller Gruppen sichtbar. Die intrazelluläre Produktion des Th1-induzierenden Transkriptionsfaktors T-bet sowie des Th1-spezifischen Zytokins IFNγ war in den geschützten Mäusen nach SP + CpG- oder Protein C + CpG-Immunisierung jedoch geringer. Eine initiale Immunisierung suszeptibler BALB/c Mäuse mit den Proteinkandidaten war sehr vielversprechend. Alle Gruppen, die mit SP, Protein C oder E (jeweils 1 µg + CpG) behandelt worden waren, entwickelten nach der Infektion nahezu keine Ohrläsionen. Im Gegensatz dazu musste der Versuch der mit Protein D + CpG oder CpG allein behandelten Mäuse frühzeitig aufgrund eines progressiven Krankheitsverlaufs beendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das erstmals identifizierte Protein C eine potentielle Quelle für protektive T-Zell-Epitope gegen L. major Parasiten gleichermaßen für sowohl resistente als auch empfindliche Mäuse darstellt und damit maßgeblich zu der Entwicklung einer Vakzine gegen die CL beitragen könnte. Infections with Leishmania spp. represent a serious health problem in more than 90 countries worldwide. Mainly because of affected individuals with immunosuppression and co-infections, a death toll of around 30,000 annually is observed. So far, an effective vaccine against human cutaneous leishmaniasis does not exist, but its development should be feasible due to the fact that immunocompetent hosts are resistant against re-infection with the same Leishmania subspecies. Healing requires the production of Th1/Tc1-associated IFNγ. To identify immunogenic proteins which could serve as potential vaccine candidates against this disease, we first partitioned highly immunogenic L. major lysate (soluble Leishmania antigen, SLA) by differential centrifugation into its components. The protective features of isolated soluble proteins (SP) in vivo were investigated by immunizing C57BL/6 mice i.d. in one ear with different amounts of protein (ranging from 10 ng up to 100 µg) combined with CpG as adjuvant in triplicate. Physiologically relevant low dose-infection was initiated with live metacyclic L. major promastigotes in the alternate ear. The protective effect of SP in vivo was strongly dose-dependent and accompanied by the progression of different lesion sizes at the site of infection. In contrast to non-protected CpG-control mice, immunization with 1 µg SP+CpG induced both CD4+ and CD8+ antigen-specific T cell proliferation in vitro. Thus, SP seem to contain highly potent components, which are beneficial for mediating effective immune responses against L. major infections. SP was fractionated by two-step anion exchange chromatography to identify and characterize single immunogenic antigens from SP. Eluted fractions were tested in vitro in a restimulation assay using dLN from L. major-infected C57BL/6 mice. Restimulation with SP revealed a dominant Th1/Tc1 cytokine profile similar to that observed after antigen-specific stimulation with SLA. Only few reactive fractions from SP were found, which induced high IFNγ levels compared to unstimulated controls. Overall, we identified 36 L. major-specific proteins in reactive fractions by quantitative mass spectrometry. Comparing the revealed protein content with the respective reactivity profile, i.e. the fraction-specific capacity to induce IFNγ production, we chose 4 candidates (protein A, C, D, and E) for further analysis. The recombinant proteins A, C, and E also induced activation and proliferation of both T cell subsets in dLN restimulation assays in vitro. In addition, their immunizing capabilities were tested in vivo with different protein doses. Interestingly, only mice treated with protein C were protected against L. major infection as they showed almost no lesion development in contrast to the other groups. No obvious differences in parasite loads were detectable in ears of C57BL/6 mice treated with CpG, SP, protein A or protein C (1 µg of each + CpG) at week 6 p.i., however, the intracellular production of the Th1-inducing transcription factor T-bet and the Th1-specific cytokine IFNγ was lower in protected mice immunized with SP or protein C with adjuvant. Finally, an initial immunization of susceptible BALB/c mice revealed promising results as all groups immunized with SP, protein C, or E (1 µg of each + CpG) showed almost no ear lesion development p.i.. In contrast, BALB/c mice treated with protein D + CpG or CpG alone needed to be sacrificed at week 9 p.i. due to disease progression. In summary, the newly identified protein C may serve in particular as a potential source for protective T cell epitopes for both resistant and susceptible mice and significantly contributes to the vaccine development against CL.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2336
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000031135
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XII, 152 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen