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Authors: Hirschhäuser, Franziska
Title: Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen
Online publication date: 4-Jan-2011
Language: german
Abstract: Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.
A new approach of immunologic cancer therapy is the use of the bispecific, trifunctional antibodies catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) and ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). The bispecifity exists in the binding to a tumor-associated antigen (EpCAM or Her2/neu) and the molecule CD3 on the surface of T-cells. In addition, the third function of the antibody is the interaction of the Fc part with FcγRI/IIa/III to positive accessory immune cells. This unique combination allows for the hypothetical formation of a tri-cell-complex. Although clinical studies have demonstrated the effectiveness of both antibodies, the real mode of action of these drugs is not well understood up to now. The interaction between strongly EpCAM- and weakly Her2/neu-positive FaDu-cells, with human Her2/neu stable transfected FaDu E593-tumor cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and trifunctional antibodies was analyzed using a 3D tumor model, the so-called multicellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid volume growth, tumor cell clonogenicity and vitality served as endpoints for evaluating the therapeutic efficiency. For analysis of the PBMC penetration into the spheroids immunohistological stainings and molecular biological analyses were performed. Accordingly, the proportions of proliferating cells (Ki67 staining) as well as the apoptotic cells (FragEL staining) were identified in the spheroids. The activity of the PBMC was characterized by the analysis of selected cytokines (ELISA) and the cell number from the media supernatant. Results obtained from FaDu- and E593-spheroids reflect a catumaxomab- and ertumaxomab-induced decrease in spheroid volume which was dependent on incubation time and concentration of the drugs. The shrinkage of the tumor spheroids went along with a reduction of the number of proliferative cells and with an increase of apoptosis. The histological findings suggest that the volume reduction is caused by an increased number of infiltrating leucocytes. Analyses on the basis of different methods revealed a dominating infiltration of cytotoxic T-cells into the tumor spheroids. The activity of T-cells was quantified by detection of the IL-2 mRNA and the secretion of the respective protein. The cytokine pattern with high levels of IFN-γ further indicates a cellular immune response. The direct comparison of both antibodies showed that the anti-tumoral effect was dependent on the level of the antigen expression regarding the tumor cells. Cytokine release into the culture supernatant was higher in the presence than in the absence of the tumor antigens. Spheroid co-cultures which were treated with the parental anti-EpCAM antibody showed no volume reduction. By contrast, the parental CD3 antibody, the CD3- and tumor cell binding F(ab')2 fragment of catumaxomab or a combination of both parental antibodies led to an anti-tumoral effect which was not as strong as that of the trifunctional antibody catumaxomab. This clearly shows that the effectiveness of catumaxomab is based on its trifunctionality. From this it can be concluded that co-stimulatory signals are necessary for the activation of the immune cells and that mechanisms like ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) via tumor antigen binding are involved. The experiments with trifunctional antibodies and immune suppressive agents have shown that a combination of both agents is possible. Nevertheless, the concentrations are to be chosen carefully in a way to reduce the cytokine release and the relating adverse side effects without the loss of the anti-tumoral effects of the antibodies. For fast proliferation after activation, T-cells attain their energy by increased aerobic glycolysis. Under treatment of the co-cultures with catumaxomab in comparison to other immune stimulatory agents, the strongest increase in the production of lactate as well as the acidification- and oxygen consumption rates was detected. These effects are suggestive of a metabolic activation of the PBMC by catumaxomab. Nevertheless, lactate produced by the tumor cells can cause an inhibition of the immune cells. Hence, an application in combination with inhibitors of glycolysis would be a possible approach to further increase the therapeutic efficacy. In addition, it could be shown that a co-medication of trifunctional antibodies with chemotherapeutics led to an additive effect. All together the future of immunological therapies probably lies in the combination with other active substance classes which improve anti-tumoral effects or inhibit immune suppressive mechanisms.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2312
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 117 S.
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