Authors:	Ding, Shaohua
Title:	In vitro synthesis of the light-harvesting complex into artificial membrane systems
Online publication date:	4-Jan-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	In green plants, the function of collecting solar energy for photosynthesis is fulfilled by a series of light-harvesting complexes (LHC). The light-harvesting chlorophyll a/b protein (LHCP) is synthesized in the cytosol as a precursor (pLHCP), then imported into chloroplasts and assembled into photosynthetic thylakoid membranes. Knowledge about the regulation of the transport processes of LHCP is rather limited. Closely mimicking the in vivo situation, cell-free protein expression system is employed in this dissertation to study the reconstitution of LHCP into artificial membranes. The approach starts merely from the genetic information of the protein, so the difficult and time- consuming procedures of protein expression and purification can be avoided. The LHCP encoding gene from Pisum sativum was cloned into a cell-free compatible vector system and the protein was expressed in wheat germ extracts. Vesicles or pigment-containing vesicles were prepared with either synthetic lipid or purified plant leaf lipid to mimic cell membranes. LHCP was synthesized in wheat germ extract systems with or without supplemented lipids. The addition of either synthetic or purified plant leaf lipid was found to be beneficial to the general productivity of the expression system. The lipid membrane insertion of the LHCP was investigated by radioactive labelling, protease digestion, and centrifugation assays. The LHCP is partially protected against protease digestion; however the protection is independent from the supplemented lipids. Lichtsammelkomplexe (light harvesting complexes, LHCs) sind eine Gruppe von Membranproteinen, die das für die Photosynthese benötigte Sonnenlicht absorbieren und die Energie an ein Reaktionszentrum weiterleiten. In der vorliegenden Arbeit wurde das light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein (LHCP), ein Apoprotein des photosynthetischen Lichtsammlerkomplexes II in Pflanzen, alternativ mittels zellfreier Expression hergestellt und die Insertion in Lipidmembranen untersucht. Im natürlichen zellulären Kontext wird das LHCP als lösliche Vorstufe im Zytosol (precursor LHCP, pLHCP) synthetisiert, in die Chloroplasten transportiert und anschließend in Thylakoidmembranen eingefügt. Die Details und Regularien des LHCP Transportprozesses sind bisher wenig verstanden. Zellfreie Proteinexpressionssysteme erlauben eine Nachbildung der in vivo Situation und einen mechanistischen Ansatz zur Untersuchung von Transport- und Insertionsprozessen. Ausgehend von der genetischen Information können Proteine direkt mittels Zelllysaten hergestellt werden, so dass die schwierige und zeitaufwendige Prozedur der konventionellen Proteinexpression und -aufreinigung vermieden werden kann. Dazu wurde das LHCP kodierende Gen aus Pisum sativum in ein für die zellfreie Expression kompatibles Vektorsystem kloniert und das Protein mittels einem zellfreien Expressionsystem basierend auf Weizenkeimen, hergestellt. Um die Umgebung einer natürlichen Zellmembran nachzubilden wurden aus synthetischen Lipide oder aufgereinigten Pflanzenlipiden Vesikel hergestellt. Dabei wurden sowohl reine Vesikel verwendet, als auch Vesikel, die Pigmente enthielten. Die Zugabe von synthetischen oder aufgereinigten Lipiden hatte einen förderlichen Effekt auf die generelle Proteinausbeute. Untersuchungen der Membraninsertion des LHCPs mittels Radioaktivmarkierung, Proteaseverdau und Zentrifugation ergaben eine teilweise Membraninsertion, wobei diese jedoch unabhängig von den zugesetzten Lipiden war.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2311
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-25482
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	111 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen