Authors:	Engels, Kristin
Title:	Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign
Online publication date:	7-Jun-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit- Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen. Infections by parasitic protozoa of the phylum Apicomplexa cause incalculable morbidity and mortality to human and domestic animals. Apicomplexan parasites include Plasmodium spp., the causative agent of malaria and Eimeria spp., the causative agent of coccidiosis, a disease especially affecting chicken and other poultry. Coccidiosis is a major problem for the global food industry not at least in developed countries. The global lost is estimated up to 3 billion US$ per annum and requires improved strategies for the effective control of eimerian parasites. Although chemo-prophylactic agents and vaccinations for the control of these parasites are available, these are ineffective because in many instances, the Eimeria spp. have developed resistance against traditional therapeutic agents. Therefore, there is an urgent need to design new affordable and effective pharmaceuticals for the control of avian coccidiosis. Cyclin-dependent kinases (CDKs) are key molecules in the regulation of the cell cycle and are therefore prominent target proteins in parasitic diseases. The CDK specific inhibitor Flavopiridol has proven in vitro and in a cell culture assay, the use of CDK-like proteins as potential protein targets. CDKs of E. tenella are therefore adequate target proteins in the development of a chemotherapy against coccidiosis. A bioinformatics analysis was performed to identify unknown CDK-like proteins in the genome of E. tenella. Almost complete genomic sequence information is available for this parasite [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. The bioinformatics analysis of the homologous CDK proteins was carried out by utilizing sequence information from CDK sequences of other apicomplexan parasites. This analysis revealed four potential CDK-like proteins of which one – E. tenella CDK-related kinase 2 (EtCRK2) – was already cloned, expressed and biochemically characterized [KINNAIRD, et al., 2004]. The remaining three were not annotated. These CDK-like sequences were named EtMRK, EtCRK1 and EtCRK3. Furthermore, a bioinformatics analysis of the corresponding cyclins – the CDK activators – was performed in order to identify potential cyclin-like sequences from E. tenella. BLAST-searches identified additional cyclin-like sequences for which one – EtCYC3a – was approved as an activator of EtCRK2 [María L. Suárez Fernández, Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim]. Sequence comparisons suggested that EtCYC1 and EtCYC3b were also able to activate EtCRK2. Moreover, it was assumed that EtCYC4 which was also identified during this study, acts as an activator of EtCRK1. A virtual screening campaign on EtCRK2, the best characterized CDK of E. tenella resulted in hits that have already been verified in vitro [BEYER, 2007]. These hit compounds were used for substructure and similarity searches in a compound database leading to a set of additional compounds with in vitro activity. These experiments led to a set of novel inhibitor lead compounds of EtCRK2. One of these lead structures contains a benzimidazole-carbonitrile scaffold. This is a novel CDK inhibitor scaffold that was not reported to inhibit CDKs before. This structure was further optimized in silico. Binding free energy calculations using the linear interaction energy (LIE) method were applied for the prediction of the correct binding mode of the benzimidazole-carbonitriles. Furthermore, in silico optimization of a virtual combinatorial compound library was performed. The selection of suitable compounds was finally carried out using molecular docking into a homology model of EtCRK2. A final selection of 15 compounds was submitted for chemical synthesis. Additionally, virtual screening campaigns were performed for E. tenella (EtMRK) and P. falciparum (PfMRK), which resulted in seven interesting in silico hits. During virtual screening, known CDK inhibitors were enriched, which indicates a reasonable in silico screening performance. These encouraging results may aid the development of new therapeutic agents against coccidiosis and malaria.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2291
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-22930
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	122 S.
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