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Authors: Bauer, Julia
Title: The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology
Online publication date: 29-Apr-2010
Language: english
Abstract: Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.\r\nUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. \r\nDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.\r\n
The facultative anaerobic enteric bacterium Escherichia coli can use C4-dicarboxylates as a carbon and energy source during aerobic and anaerobic growth. C4-dicarboxylate uptake and energy conservation via fumarate respiration is regulated by the two-component system DcuSR. In response to C4-dicarboxylates, the sensor kinase DcuS and the response regulator DcuR activate expression of the genes coding for the succinate carrier DctA, the anaerobic fumarate/succinate antiporter DcuB, the fumarase B and the fumarate reductase FrdABCD. The transporters DctA and DcuB show a severe regulatory effect on DcuSR dependent gene expression under aerobic and anaerobic conditions. Deletion of DctA or DcuB causes a strongly increased expression of dctA´-´lacZ or dcuB´-´lacZ in the absence of effector, implying a negative effect of the transporters on C4-dicarboxylate-sensing. For DcuB, independent sites for transport and regulation were identified by random and site-directed mutagenesis, indicating that DcuB is a bifunctional protein which acts as a second sensor of the DcuSR system.\r\nIn this work, the topology of membrane-embedded DcuB and of the regulatory sites was determined by reporter gene fusions with the alkaline phosphatase and the ß-lactamase. In addition, labeling experiments with membrane-permeable and membrane-impermeable sulphydryl reagents were performed to identify accessible amino acid residues of DcuB. The data indicate the existence of a deep aqueous channel opened to the periplasmic side of the membrane. Based on the results of the topology mapping, on a hydropathy blot and predicted secondary structure, a topology model of DcuB was created. DcuB contains 12 transmembrane helices with short C- and N-termini ends located in the periplasm and two large hydrophilic loops between TM VII/VIII and TM XI/XII. The regulatory competent residues K353, T396 and D398 are located in TM XI and the adjacent cytoplasmic loop XI-XII. The data from structural and functional studies were applied to predict a model of C4-dicarboxylate-dependent gene expression by combined action of the carrier DcuB and the sensor kinase DcuS. \r\nThe effect of DctA and DcuSR on the expression of dctA´-´lacZ and C4-dicarboxylate uptake under aerobic conditions was investigated by ß-galactosidase assays and growth experiments. Interaction studies by using fusions of DctA and DcuS with derivatives of the green fluorescent protein for in-vivo FRET measurements showed a direct interaction between the carrier DctA and the sensor DcuS. This finding strongly supports the model of regulation of DcuS by C4-dicarboxylates and DctA or DcuB as cosensor by direct interaction.\r\n
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2264
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 138 S.
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