Authors:	Dornhoff, Heike
Title:	Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
Online publication date:	14-Apr-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen. TGF-beta is a key molecule in cell associated immune tolerance. Beside its pleiotropic effect in immune cells it also plays a significant role in tumor development, where it displays a dual role. In the early stages of tumor development it serves as a tumor suppressor but in the ungoing tumor development it rather acts as a tumor promotor. That is why a strict regulation of the TGF-beta signaling pathway is very necessary for a functional immune system. The ubiquitin ligase Smurf2 is an important negative regulator of this pathway. This work describes the isolation of a new spliceform of Smurf2 (dE2Smurf2) from murine CD4 T-cells and its functional role in T-lymphocytes in-vitro and in-vivo. Additionally, the relevance was also proved for in humans. The overexpression of both spliceforms of Smurf2 (dE2 and WT) in cos7 cells revealed a different localisation in the cell. The expression of the dE2Smurf2 form was demonstrated in lysosomal and endosomal compartments of the cell. The splicing of the exon2 from the Smurf2 gene lead to changes in the topology of the N-terminal C2-domain which caused a different localisation in the cell. In addition changes in the functionality of the dE2Smurf2 ubiquitin ligase were found. Surprisingly, an enhanced strong induction of the TGF-beta signaling pathway was observed, which is discrepancy to the WT-Smurf2. The overexpression of the dE2Smurf2 protein in T-lymphocytes also revealed an upregulation of the TGF-beta signaling in CD4 and CD8 T-cells. This enhanced signaling is due to an overexpression of the TGFbetaRII through which transcription factors like Smad2 and Smad3 were extensively phosphorylated after TGF-beta stimulation. Thus, transgenic T-lymphocytes showed a higher sensitivity against TGF-beta. This leads to the hypothesis that the WT-form of Smurf2 is degraded by the overexpressed dE2Smurf2 form, which was confirmed by western blot analysis. The degradation of the ubiquitin ligase was Smad7 dependent. Differentiation and proliferation assays of transgenic CD4 T-cells displayed a higher sensitivity against TGF-beta. Transgenic T-cells differentiated more frequently into IL17 producing T-cells in the presence of IL6 and TGF-beta and they also showed a strong suppression of their proliferation rate after TGF-beta stimulation. Moreover, after differentiation of naïve transgenic CD4 T-cells into TH1 cells, they produced significant lower amounts of the proinflammatory cytokine INFgamma. In-vivo experiments showed that the transgenic mice were protected from colorectal cancer, both in the colitis associated tumor model as well as in the sporadic APCmin model. This could be defined due to the diminished inflammation of the gut caused by lower inflammatory cytokine production and a stronger production of cytotoxic genes like perforin, granzyme B and INFgamma in CD8 T-cells. Interestingly, dE2Smurf2 provide evidence for a stronger inflammatory effect in a transfer colitis model. The immune deficient mice, which were injected with the transgenic T-cells, displayed a significant stronger colitis compaired to the controls, which could be explained by an overproduction of the Interleukin 17. Cloning experiments lead to the identification of a novel non-coding RNA so far. Reportergene analysis of this non-coding RNA in combination with the dE2Smurf2 protein revealed a hyperactivation of the Smad3 promotor. These data yield a precise model about the regulation of the TGF-beta signaling pathway and shows important findings in the pathophysiology of inflammatory bowel disease and resultant carcinogenesis. Thus, Smurf2 part of the TGF-beta signalling pathway emerges as an attractive target for the modulation of inflammatory bowel disease and colitis associated colorectal cancer.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2251
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-22385
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen