Authors:	Jöst, Eva
Title:	Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon
Online publication date:	1-Apr-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann. Patients diagnosed with pancreatic cancer or malignant melanoma have a very poor prognosis. This is due to the high resistance of these tumours to chemotherapy or irradiation. First line therapy of pancreatic cancer consists of 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin (CDDP) and ionizing radiation (IR). For melanoma, the methylating agents dacarbazine (DTIC) or temozolomide (TMZ) are used. To increase the response of both tumour types to irradiation or chemotherapy, interferons (IFNs) are used as radio- or chemo-sensitizers. In the present study we determined whether IFNs have an effect on the efficiency of IR or TMZ in the treatment of pancreatic cancer cells and melanoma cells and furthermore, which mechanism is responsible for this effect. To this end, we used a panel of ten pancreatic cancer cell lines (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, BxPc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, MiaPaCa-2 and PA-TU 8902). These cell lines showed a high variation in their intrinsic radio-sensitivity as well as their sensitivity towards IFN-alpha or IFN-beta. The radio-sensitization effect was moderate, with IFN-beta being more effective than IFN-alpha. An increase of the alpha-values of the survival curves paralleled the sensitization effect. Using two independent methods, it was shown that IFN-beta caused an enhancement of IR-induced apoptosis. IFN-beta did not have an influence on cell cycle progression or DNA repair. Also a chemo-sensitization effect of IFNs on TMZ treatment was not shown in pancreatic cancer cells, neither under O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) proficient or deficient conditions. To elucidate the chemo-sensitization effect of IFNs on TMZ in malignant melanoma cells four different cell lines were used that differ in their p53 status. D05 and A375 were p53 wild-type while D14 and RPMI 7951 were p53 mutated. These cell lines were compared as to their sensitivity towards TMZ in the presence and absence of IFNs. Both, IFN-alpha and -beta significantly increase the apoptotic response, with IFN-beta showing the stronger effect. The chemo-sensitization effect was most prominent in the p53 wild-type cell lines and under MGMT depleted conditions. Transfection with MGMT cDNA completely abolishes the sensitization effect of IFN-beta, showing that IFN-beta sensitises melanoma cells to the killing effect of the DNA damage O6-methylguanine (O6MeG). Using western blot analysis and gamma-H2AX foci formation no influence of IFN-beta on the repair or processing of the lesion O6MeG could be shown. Transfection of the cells with DN-FADD, or experiments with a FAS-activating antibody showed that p53 wild-type melanoma cells have a defect in the death-receptor (Fas/CD95) pathway which can be restored by IFN-beta treatment. Using caspase-8 siRNA it was shown that this reactivation is caused by an IFN-beta provoked induction of pro-caspase-8. This work showed for the first time that p53 wild-type melanoma cells are unable to use the Fas-receptor pathway because of a low level of pro-caspase-8, which can be overcome by an IFN-beta mediated induction of the pro-caspase-8 protein level. Because most melanoma cells are p53 wild-type, this work clarifies a mechanism whereby high chemo-resistance of melanoma cells can be overcome.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2237
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-22196
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
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