Authors:	Hüsken, Katrin
Title:	Identifizierung und Charakterisierung von Intermediärfilament-Organisatoren in Caenorhabditis elegans
Online publication date:	22-Sep-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Intermediärfilamente (IFs) sind neben Mikrotubuli und Aktinfilamenten die dritte filamentäre Komponente des Zytoskeletts. Sie wirken als mechanische Stabilisatoren, sind außerdem an Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose beteiligt und tragen zu Zellpolarität bei. IFs sind dynamische Strukturen, die zelltypspezifisch in unterschiedlichen Anordnungen und Abundanzen vorkommen und von Signalkaskaden beeinflusst werden. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser fein abgestimmten Prozesse sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deswegen ein Tiermodell entwickelt werden, um Regulatoren der IF-(Netzwerk)-Organisation in vivo zu untersuchen und zu identifizieren. Dazu wurde C. elegans ausgewählt, da es sich hierbei um einen genetisch gut charakterisierten und leicht manipulierbaren Organismus handelt, in dessen Genom elf Gene für zytoplasmatische IFs kodieren. Zunächst wurden stabil transgene C. elegans-Linien generiert, die fluoreszierende IFs exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass das darmspezifische IFB-2::CFP im Bereich des apikalen Junktionskomplex verankert ist und nahezu vollständig im subapikalen Terminalgeflecht der Enterozyten lokalisiert, das als Teil der endotube besonders stabil und widerstandsfähig ist. Wenn diese Tiere mit dsRNA gegen das ebenfalls im Terminalgeflecht exprimierte IF ifc-2 behandelt wurden, entwickelten sich blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens, die auf eine Schwächung der rigiden und formgebenden endotube hinwiesen und damit einen direkten in vivo-Beweis für die stressprotektive Funktion des intestinalen IF-Netzwerks lieferten. Die leichte Detektierbarkeit des IFB-2::CFP-Musters wurde in einem optischen Screen ausgenutzt, bei dem nach chemischer Mutagenese nach Veränderungen im IF-Muster gefahndet wurde. Hierbei wurden drei Mutanten isoliert. In Komplementationsanalysen stellte sich heraus, dass es sich in zwei Fällen um Allele desselben Gens handelt. Die Identifizierung der betroffenen Gene gelang durch eine PCR-basierte Kartierung von single nucleotide polymorphisms nach Verpaarung mit dem Hawaii-Stamm (snp-mapping) und anschließender RNAi-Analyse der Einzelgene in den identifizierten Chromosomenabschnitten. Im einen Fall handelte es sich um das sma-5-Gen, einer Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu den MAP- Kinasen MAPK7/ERK5 der Säuger. Hier wurden, ebenso wie beim ifc-2 (RNAi)-Phänotyp, progressive blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens beobachtet. Die beiden anderen Allele tragen Mutationen in einem bisher nicht näher charakterisierten Gen. In diesen Würmern kommt es zu einem vollständigen Auflösung des IFB-2::CFP-Netzwerks mit prominenten Akkumulationen um die apikalen Junktionen. Das Darmlumen ist stellenweise geweitet und das elektronendichte Terminalgeflecht fehlt fast vollständig, die Integrität des Darmepithels ist jedoch nicht kompromittiert. Die anderen IFs des Terminalgeflechts sind ebenfalls fehlverteilt, und die intestinale Expression von Aktin ist stark reduziert. Expressionskonstrukte des Gens zeigten weiterhin, dass es darmspezifisch synthetisiert wird und mit den IFs im Terminalgeflecht kolokalisiert. Das Protein ist, ähnlich wie das IF-assoziierte Filaggrin der Säuger ausgesprochen histidinreich. Es enthält außerdem eine Prolin-reiche Domäne, die Teil einer potentiellen Aktin-Bindedomäne ist. Auf Grund all dieser Eigenschaften wird die Bezeichnung IFO-1 (intermediate filament organizer) für das neue Protein vorgeschlagen, das möglicherweise als struktureller Zytoskelett-Linker wirkt. Die vorgestellten Ergebnisse untermauern die Bedeutung von C. elegans für die Identifizierung von Faktoren, die IF-Netzwerke regulieren, und die Möglichkeit, Defekte im lebenden Gesamtorganismus zu bestimmen. Besides microtubules and actin filaments, intermediate filaments (IFs) constitute the third fibrous component of the cytoskeleton. They provide mechanical stability for cells, help to constitute cell polarity and play roles in cellular differentiation, proliferation, and apoptosis. IFs are dynamic structures which appear in cell-type specific manners, arrangements and abundances and which are regulated by signaling cascades. So far, the underlying molecular mechanisms of these precisely coordinated processes are barely understood. We therefore decided to develop an animal model which allows us to study and characterize IF organization and/or networking in vivo. C. elegans was chosen because it represents a genetically well characterized and easily manipulatable organism whose genome comprises 11 genes encoding cytoplasmic IFs. Initially, we generated stable transgenic C. elegans strains expressing fluorescent IFs. Thus we could demonstrate that the intestine-specific IFB-2::CFP localizes at the apical junctional complex and almost completely in the enterocytic subapical terminal web, which is part of the mechanically stable and rigid endotube. When these animals were treated with dsRNA against the terminal web-specific IF ifc-2 the intestinal lumen developed multiple bubble-shaped protuberances which indicate impairment of the endotube. This finding provides direct in vivo evidence for the stress protective function of the intestinal IF system. Due to its easily detectable pattern, the worms expressing IFB-2:: CFP were employed in an optical screening assay in which animals with altered IF patterns were identified after chemical mutagenesis. As a result, three mutant lines were isolated, two of which have mutations in the same gene as shown by a complementation assay. Identification of the mutant genes was accomplished by SNP mapping, which comprises PCR based detection of single nucleotide polymorphisms as genetic markers, and by RNAi of the genes located in the identified chromosomal intervals. One mutation affects the sma-5 gene which encodes a serine/threonine kinase, homologous to the MAP kinase MAPK7/ERK5 of mammals. These worms display progressive bubble-shaped exvaginations of the intestinal lumen resembling the phenotype of ifc-2(RNAi) treated animals. The other two strains carry mutations in a yet uncharacterized gene. These worms exhibit a complete breakup of the IFB-2::CFP network, with prominent accumulations around the apical junctions. Although the intestinal lumen is partially widened and the electron dense terminal web is almost completely absent, the integrity of the intestinal lumen is intact. Other IFs of the terminal web are mislocalized in the same manner and the intestinal actin expression is clearly reduced. Analyses of the expression pattern illustrated an intestine specific synthesis of the novel protein and a colocalization with the IFs in the apical terminal web. Like the IF associated protein filaggrin of mammals, the protein is extraordinarily rich in histidines. Furthermore, it contains a proline-rich domain as part of a potential actin-binding site. Based on these properties we propose the denotation ifo-1 (intermediate filament organizer) for the novel protein which might act as a structural cytoskeletal linker. These results substantiate the relevance of C. elegans for the identification of factors which regulate IF networks and the possibility to determine defects in a living organism.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2194
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-17256
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen