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Authors: Schmidt, Heike
Title: Expression profiling und rationale Expressionsoptimierung am Beispiel eines prokaryontischen Wirt-,Vektor-Systems
Online publication date: 18-Sep-2008
Language: german
Abstract: Durch globale Expressionsprofil-Analysen auf Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Ebene können biotechnologische Produktionsprozesse besser verstanden und die Erkenntnisse für die zielgerichtete, rationale Optimierung von Expressionssystemen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überexpression einer Glukose-Dehydrogenase (EC 1.1.5.2), die von der Roche Diagnostics GmbH für die diagnostische Anwendung optimiert worden war, in Escherichia coli untersucht. Die Enzymvariante unterscheidet sich in sieben ihrer 455 Aminosäuren vom Wildtyp-Enzym und wird im sonst isogenen Wirt-/Vektor-System in signifikant geringeren Mengen (Faktor 5) gebildet. Das prokaryontische Expressionssystem wurde auf Proteom-Ebene charakterisiert. Die 2-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) wurde zuvor unter statistischen Aspekten untersucht. Unter Berücksichtigung von technischen und biologischen Variationen, falsch-positiven (α-) und falsch-negativen (β-) Fehlern sowie einem daraus abgeleiteten Versuchsdesign konnten Expressionsunterschiede als signifikant quantifiziert werden, wenn sie um den Faktor ≥ 1,4 differierten. Durch eine Hauptkomponenten-Analyse wurde gezeigt, dass die DIGE-Technologie für die Expressionsprofil-Analyse des Modellsystems geeignet ist. Der Expressionsstamm für die Enzymvariante zeichnete sich durch eine höhere Variabilität an Enzymen für den Zuckerabbau und die Nukleinsäure-Synthese aus. Im Expressionssystem für das Wildtyp-Enzym wurde eine unerwartet erhöhte Plasmidkopienzahl nachgewiesen. Als potenzieller Engpass in der Expression der rekombinanten Glukose-Dehydrogenase wurde die Löslichkeitsvermittlung identifiziert. Im Expressionsstamm für das Wildtyp-Enzym wurden viele Proteine für die Biogenese der äußeren Membran verstärkt exprimiert. Als Folge dessen wurde ein sog. envelope stress ausgelöst und die Zellen gingen in die stationäre Wuchsphase über. Die Ergebnisse der Proteomanalyse wurden weiterführend dazu genutzt, die Produktionsleistung für die Enzymvariante zu verbessern. Durch den Austausch des Replikationsursprungs im Expressionsvektor wurde die Plasmidkopienzahl erhöht und die zelluläre Expressionsleistung für die diagnostisch interessantere Enzymvariante um Faktor 7 - 9 gesteigert. Um die Löslichkeitsvermittlung während der Expression zu verbessern, wurde die Plasmidkopienzahl gesenkt und die Coexpression von Chaperonen initiiert. Die Ausbeuten aktiver Glukose-Dehydrogenase wurden durch die Renaturierung inaktiven Produkts aus dem optimierten Expressionssystem insgesamt um einen Faktor von 4,5 erhöht. Somit führte im Rahmen dieser Arbeit eine proteombasierte Expressionsprofil-Analyse zur zielgerichteten, rationalen Expressionsoptimierung eines prokaryontischen Modellsystems.
Global expression profiling analyses on transcriptome-, proteome- or metabolome-level help understanding biotechnological production processes. Furthermore, data can be used for target-oriented, rational optimization of recombinant expression systems. In this work overexpression of a recombinant glucose-dehydrogenase (GlucDH, EC 1.1.5.2) in Escherichia coli was investigated. The enzyme was optimized by Roche Diagnostics GmbH for diagnostic purposes. Therefore the GlucDH variant differs in seven out of 455 amino acids from the wild type enzyme. Although using an isogenic host-/vector-system the enzyme variant is produced in significant lower amounts (factor 5). For expression profiling the prokaryotic expression systems were characterized on the proteome level by use of 2-dimensional difference gel electrophoresis (DIGE). Prior to analysis the DIGE-technique was investigated under statistical aspects. Considering technical and biological variation, false-positive (α-) and false-negative ( β-) mistakes as well as a deduced experimental design, expression differences of ≥ 1.4 could be detected. Principal component analysis showed that DIGE-technology could be used for expression profiling analysis of the GlucDH model system. The expression system of the GlucDH variant was designated by a higher variability of enzymes for sugar degradation and the synthesis of nucleic acids. Within the GlucDH wild type expression system an unexpected higher plasmid copy number was detected. Proteome analysis revealed mediation of solubility as a bottle neck during recombinant GlucDH expression. In the wild type system various proteins for biogenesis of the outer membrane were expressed in increased amounts. As a consequence envelope stress was induced and cells turned into stationary growth phase. Subsequently the proteome analysis was used to enhance protein expression of the diagnostic important GlucDH variant. By substitution of the origin of replication in the expression vector plasmid copy number was raised and cellular expression performance could be increased by factors 7 to 9. In order to optimize solubilization, reduction of plasmid copy number was tested and the coexpression of chaperones was initiated. Higher yields of active GlucDH were achieved by renaturation of expressed, but inactive product of the optimized expression system by a total factor of 4.5. In conclusion, a proteome based expression profiling analysis could be used for a target-directed, rational expression optimization of a prokaryotic model system.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2191
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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