Authors:	Wagener, Karolin
Title:	In vivo evaluation of nanodimensional drug delivery systems via positron emission tomography
Online publication date:	13-Aug-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	In vivo tracking is crucial for the pre-clinical evaluation of drug delivery systems (DDSs), in order to understand structure-property relationships of the DDSs and their resulting pharmacokinetic profile. Among nuclear medical imaging tools, positron emission tomography (PET) is a noninvasive technique, allowing for quantification and providing an excellent spatial and temporal resolution. Because of these advantages, PET bears great potential in the evaluation of DDSs. In the herein presented work, different nanodimensional DDSs were evaluated via PET and/or biodistribution studies in mice and rats. By the utilization of the radionuclides 18F, 131I and 64Cu, various research questions could be answered. First, random (ran) copolymers consisting of N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HMPA) and lauryl methacrylate (LMA), which had shown favorable short-term in vivo characteristics in former studies, were radiolabeled with 131I. The longer-lived radioisotope 131I enabled tracking of their pharmacokinetics in tumor-bearing rats over three days. Despite a polymer clearance from the blood within this time span, there was an increase in tumor uptake observable over time, which strongly emphasizes the enhanced permeability and retention (EPR) effect. Another part of this work focused on the in vivo evaluation of stealth liposomes. These spherical vesicles exhibit an excellent biocompatibility as well as a low toxicity. A polymer shell prevents them from being detected by the mononuclear phagocyte system (MPS). For this purpose, one needs to ensure a stable anchorage into the lipid bilayer, ideally paired with multifunctionality, which enables the linkage of different modalities (e.g. radiolabel and targeting vector). Thus, different multifunctional hyperbranched polyglycerols (hbPG) with a dialkyl anchor and their respective liposomal formulations were investigated in PET and biodistribution studies in mice, with respect to liposome stability. To compare hbPG and the gold standard PEG regarding their shielding properties, also a PEG lipid was examined. The polyether lipids were rapidly cleared via the renal system, whereas the corresponding liposomes circulated in the blood stream over the period of investigation. Overall, liposomes shielded by the hbPG lipids exhibited a favorable biodistribution, rendering them promising novel nanovesicles for drug transport and targeting. Radiolabeling of the polyether lipids was carried out prior to the liposome formation via copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) using 1-azido-2-(2-(2-[18F]fluoroethoxy)ethoxy)ethane ([18F]F-TEG-N3). This approach ensured the separation of cytotoxic copper, but entailed a time-consuming radiosynthesis on the other hand. Thus, a direct radiolabeling of preformed liposomes was tested. Herein, a main emphasis lay on the quantification of the retained amount of copper upon purification. For this purpose, 64Cu was utilized as catalyst for the CuAAC between liposomes and non-radioactive F-TEG-N3. In this way, the final copper content of the liposomes could straightforwardly be quantified by gamma spectrometry, revealing that only 0.018 % of the added radioactivity was still associated with the liposome after purification. The ration of retained copper is so low, that an in vivo application of the liposomes is absolutely reasonable. In the last part of this work, hbPG-shielded liposomes, bearing multiple carbohydratic trimannose molecules on their surface, were investigated, regarding their potential to address dendritic cells (DCs) in vivo. DCs are professional antigen-presenting cells, which initialize all antigen-specific immune responses. Thus, they are a compelling target in cancer immunotherapy. The in vivo fate of the trimannosylated liposomes was evaluated via in vivo PET and ex vivo biodistribution studies in mice and the results were compared to similar liposomes bearing no trimannose on their surface. Here, the multifunctionality of hbPG was beneficial, as the 18F-label for tracking and the trimannose-label for DC-targeting could be implemented on the same molecule. It was found that the mannosylated liposomes highly accumulated in liver, spleen and bone marrow, compared to their non-mannosylated counterparts. These findings suggest, that the mannosylated liposomes were recognized by DCs, expressed in the mentioned organs. However, it cannot be excluded that other antigen-presenting cells, besides DCs, have also be targeted. Future cell studies on murine splenic immune cells have to elucidate which cell types are addressed in particular and to which extent. For this purpose, Oregon Green 488-labeled polyether lipids and respective liposomal formulations have already been synthesized. Für die Entwicklung von Wirkstofftransportsystemen (WTSs) ist eine präklinische in vivo Evaluierung unerlässlich, um Informationen über deren Pharmakokinetik zu erhalten. Dazu birgt die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), als nichtinvasives bildgebendes Verfahrenm, ein großes Potential. In der hier vorgestellten Arbeit wurden verschiedene nanodimensionale WTSs mittels PET und/oder Biodistributionsstudien an Mäusen und Ratten evaluiert. Durch den Einsatz der Radionuklide 18F, 131I und 64Cu konnten verschiedene Fragestellungen beantwortet werden. Zunächst wurden statistische Copolymere aus N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HMPA) und Laurylmethacrylat (LMA), die in früheren Studien über einen kurzen Zeitraum gute in vivo-Eigenschaften gezeigt hatten, mit 131I radioaktiv markiert. Das längerlebige Radioisotop 131I ermöglichte die Untersuchung ihrer Pharmakokinetik in tumortragenden Ratten über drei Tage. Trotz einer vollständigen Clearance des Poylmers aus dem Blut innerhalb dieser Zeitspanne war eine Zunahme der Tumoraufnahme zu beobachten, was sich mit dem sogenannten EPR-Effekt (engl. enhanced permeability and retention) erklären lässt. Ein weiterer Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die in vivo-Evaluierung von Stealth-Liposomen. Diese kugelförmigen Vesikel weisen eine ausgezeichnete Biokompatibilität sowie eine geringe Toxizität auf. Eine Polymerhülle verhindert deren Erkennung durch das mononukleäre Phagozytensystem (MPS). Dazu muss eine stabile Verankerung der Polymere in der Lipid-Doppelschicht der Liposomen gewährleistet sein, idealerweise gepaart mit einer Multifunktionalität der Polymere, welche die Anbindung verschiedener Modalitäten (z.B. Radiolabel und Targeting-Vektor) ermöglicht. Daher wurden unterschiedliche multifunktionale hyperverzweigte Polyglycerine (hbPG) mit einem Dialkylanker und ihre jeweiligen liposomalen Formulierungen in PET- und Biodistributionsstudien an Mäusen untersucht. Dies geschah mit Fokus auf der in vivo-Stabilität der Liposomen. Die reinen Polyetherlipide unterlagen einer schnellen renalen Ausscheidung. Ihre entsprechenden liposomalen Formulierungen dagegen zirkulierten über den Untersuchungszeitraum in der Blutbahn. Insgesamt zeigten die Liposomen eine günstige Biodistribution, so dass sie vielversprechende Kandidaten für Medikamententransport und aktives Targeting darstellen. Die Radiomarkierung der Polyetherlipide mit 1-Azido-2-(2-(2-[18F]fluorethoxy)ethoxy)ethan ([18F]F-TEG-N3) erfolgte, vor der Liposomenbildung, über eine kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC). Dieser Ansatz stellte die Abtrennung von zytotoxischem Kupfer sicher, erforderte aber auf der anderen Seite eine zeitaufwändige Radiosynthese. Daher wurde eine direkte Radiomarkierung von vorgeformten Liposomen getestet, mit Fokus auf der Quantifizierung der nach der Reinigung der Liposomen noch vorhandenen Kupfermenge. Dazu wurde 64Cu als Katalysator für die CuAAC zwischen Liposomen und nicht-radioaktivem F-TEG-N3 eingesetzt. Auf diese Weise ließ sich der finale Kupfergehalt der Liposomen mittels Gammaspektrometrie quantifizieren. Es zeigte sich, dass nach der Reinigung nur noch 0,018 % der zugeführten 64Cu-Radioaktivität mit den Liposomen assoziiert waren. Der geringe Anteil macht eine in vivo-Applikation der Liposomen absolut vertretbar. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden hbPG-abgeschirmte Liposomen, die mehrere Moleküle des Kohlenhydrats Trimannose auf ihrer Oberfläche trugen, hinsichtlich ihres Potenzials, dendritische Zellen (DCs) in vivo zu targetieren, untersucht. DCs sind professionelle antigenpräsentierende Zellen, die alle antigenspezifischen Immunantworten initialisieren. Damit sind sie ein vielversprechender Ansatzpunkt für eine aktive Krebsimmuntherapie. Die Pharmakokinetik der trimannosylierten Liposomen wurde mittels in vivo PET und ex vivo Biodistributionsstudien an Mäusen untersucht und die Ergebnisse mit gleichen, nicht-mannosylierten Liposomen verglichen. Hier war die Multifunktionalität von hbPG von Vorteil, da das 18F-Label (Imaging) und das Trimannose (Targetierung von DCs) an ein und das selbe Molekül angebunden werden konnten. Die mannosylierten Liposomen akkumulierten im Vergleich zu ihren nicht mannosylierten Pendants, stark in Leber, Milz und Knochenmark, was darauf hindeutet, dass sie von DCs erkannt wurden. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden auch andere antigenpräsentierende Zellen targetiert wurden. Zukünftige Zellstudien an murinen Milz-Immunzellen müssen daher klären, welche Zelltypen adressiert werden und in welchem Ausmaß. Zu diesem Zweck wurden bereits Oregon Green 488-markierte Polyetherlipide und entsprechende liposomale Formulierungen synthetisiert.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2182
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000021921
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	208 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen