Authors:	Hammann, Jens
Title:	Influence of Na+, K+-ATPase and Na+/Ca2+ exchanger on developmental ion signaling and MBP synthesis in murine oligodendrocyte precursor cells
Online publication date:	25-Jul-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	In the present thesis it was hypothesized that the expression of MBP could be altered by local [Na+]i and [Ca2+]i transients occurring in murine OPCs. In OPC monocultures MBP synthesis starts at around DIV4. Therefore, experiments in OPC monocultures at day in vitro (DIV) 2-6 were performed. Also transient elevations of resting [Ca2+]i and [Na+]i in OPCs were observed at DIV4-5. A similar, but slower increase of resting [Ca2+]i and [Na+]i was also observed in acute callosal brain slices. Chronic treatment of OPCs for 24 hours with culture medium containing elevated [K+] (+5 mM) decreased resting [Na+]i and enhanced MBP synthesis. At the same time, blocking the reverse mode of the Na+, Ca2+ exchanger (NCX) for 12 hours with KB-R7943 (1 µM) elevated resting [Na+]i and decreased MBP synthesis. OPC depolarization after 12 hours of chronic ouabain application (500 nM), a Na+, K+-ATPase (NKA) blocker, stimulated MBP synthesis as well. At single cell level NCX blockade, the elevation of extracellular [K+] and partial NKA inhibition led to [Na+]i transients in OPCs. The latter two, [K+]e elevations and NKA blockade resulted in [Ca2+]i oscillations. Those [Ca2+]i oscillations were blocked by application of KB-R7943 (1 µM), but not with Cd2+ (100 µM), indicating an involvement of the NCX reverse mode. Already small concentrations of ouabain (10 nM) successfully induced [Ca2+]i oscillations as well. Moreover it was demonstrated that cultured OPCs express the alpha2 isoform of NKA (α2-NKA) which has a high affinity for ouabain. Therefore it was hypothesized that the [Ca2+]i oscillations are mediated by α2-NKA. Similar to its blocking, knocking down the α2-NKA with small interfering (si)RNA (α2-siRNA) significantly potentiated MBP synthesis at DIV4 and 5. This potentiation was completely abolished by a chronic application of KB-R7943 (1 μM) for 24 hours. Additionally to the MBP potentiation, α2-NKA knockdown also increased the frequency of NCX-mediated spontaneous Ca2+ transients ([Ca2+]t) at DIV4, while in control cultures comparable frequency of [Ca2+]t was observed at DIV5. The [Ca2+]t were only observed in a narrow time window (DIV4-5), disappeared nearly completely at DIV6, in control as well as in α2 siRNA-treated cultures. However, knockdown of MBP did not show any influence on the α2-NKA expression, but the [Ca2+]t remained even at DIV6. A homogeneous distribution of α2-NKA was detected via immunocytochemical analyses and showed co-localization with MBP in proximal processes of immature OPCs. Later in cell development, the co-localization was only weakly present in MBP-enriched membrane sheets. In cortical organotypic slice cultures the knockdown of α2-NKA did not alter the levels of MBP but reduced co-localization of neurofilament- and MBP-positive compartments. Summarizing the results, it is suggested that α2-NKA keeps the local membrane potential of the OPCs close to the reversal potential of NCX. A depolarization, caused by a neuronal activity dependent elevation of [K+]e in the vicinity, leads to a flip of the NCX into reverse mode, intruding Ca2+ into the cell. This Ca2+ influx initiates [Ca2+]t in OPC processes which seems to positively influence the local MBP expression. In der vorliegenden Dissertation wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Expression von MBP in murinen OPCs (oligodendrocyte precursor cells) durch lokal auftretende [Na+]i- und [Ca2+]i-Transienten verändert werden kann. In OPC-Monokulturen startet die MBP-Synthese ungefähr an DIV4. Aus diesem Grund wurden Experimente in OPC-Monokulturen zwischen DIV2-6 (DIV = days in vitro; Tage in vitro) durchgeführt. Vorübergehende Erhöhungen der Ruhekonzentrationen von [Na+]i und [Ca2+]i wurden dabei auch zwischen DIV4 und DIV5 in OPCs festgestellt. Ein ähnlicher, jedoch langsamerer, Anstieg der Ruhekonzentrationen von [Na+]i und [Ca2+]i konnte auch in Hirnschnitten im Corpus callosum nachgewiesen werden. Die chronische Behandlung von OPCs über einen Zeitraum von 24 Stunden mit einem Kulturmedium, das eine erhöhte Konzentration von K+ aufwies (+5 mM), verringerte die Ruhekonzentration von [Na+]i und verstärkte die MBP-Synthese. Der Rückwärtsmodus des Na+-Ca2+-Austauscher (NCX) wurde über einen Zeitraum von 12 Stunden mit KB-R7943 (1 µM) blockiert. Dies führte zu einer Erhöhung der Ruhekonzentration von [Na+]i und verringerte die MBP-Synthese. Die 12-stündige chronische Applikation von Ouabain (500 nM), einem Blocker der Na+-K+-ATPase (NKA), führte zu einer Depolarisation der OPCs und einer Stimulation der MBP-Synthese. Auf Einzelzellebene führten die Blockierung von NCX, die Erhöhung von extrazellulärem K+ ([K+]e) und das teilweise Blockieren der NKA zu [Na+]i-Transienten in OPCs. Die Erhöhung von [K+]e und das teilweise Blockieren der NKA resultierten zudem in [Ca2+]i-Oszillationen. Diese [Ca2+]i-Oszillationen wurden durch die Applikation von KB-R7943 (1 µM), jedoch nicht durch Cd2+ (100 µM), unterbunden, was darauf hinweist, dass der Rückwärtsmodus des NCX hierbei involviert ist. Darüber hinaus induzierten bereits geringe Konzentrationen von Ouabain erfolgreich [Ca2+]i-Oszillationen. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass kultivierte OPCs die alpha2-Isoform der NKA (α2-NKA) exprimieren. Diese α2-NKA weist eine hohe Affinität zu Ouabain auf. Demzufolge wurde angenommen, dass die [Ca2+]i-Oszillationen durch α2-NKA vermittelt werden. Genau wie die Blockierung von α2-NKA, führte auch ihr Knockdown mittels small interfering (si)RNA (α2-siRNA) zu einer signifikanten Verstärkung der MBP-Synthese an DIV4 und 5. Diese Verstärkung wurde vollständig durch die 24-stündige chronische Applikation von KB-R7943 (1 µM) aufgehoben. Parallel zur Verstärkung der MBP-Synthese erhöhte der α2-NKA-Knockdown auch die Frequenz der NCX-vermittelten spontanen [Ca2+]i Transienten ([Ca2+]t) an DIV4, während eine vergleichbare Frequenz an [Ca2+]t in Kontrollkulturen erst an DIV5 auftrat. Die [Ca2+]t wurden jedoch nur in einem engen Zeitfenster (DIV4-5) nachgewiesen und verschwanden beinahe vollständig an DIV6, sowohl in Kontrollkulturen, als auch in α2-siRNA-behandelten Kulturen. Der Knockdown von MBP zeigte zwar keinen Einfluss auf die α2-NKA-Expression, verhinderte jedoch die reduzierte Frequenz von [Ca2+]t an DIV6. Weiterhin konnte mittels immunozytochemischer Analysen eine homogene Verteilung von α2-NKA demonstriert und eine Kolokalisation mit MBP in den proximalen Fortsätzen von unreifen OPCs nachgewiesen werden. In späteren Entwicklungsstadien der OPCs konnte hingegen nur noch eine sehr schwache Kolokalisation in den Myelin-Membranen gezeigt werden. In kortikalen organotypischen Schnittkulturen veränderte der Knockdown von α2-NKA zwar nicht die MBP-Level, führte allerdings zu einer verminderten Kolokalisation von Neurofilament und MBP-positiven Abteilen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass α2-NKA das lokale Membranpotenzial von OPCs nahe dem des Rückwärtsmodus des NCX hält. Die neuronale Aktivität eines nahegelegenen Axons führt zu einer Erhöhung von [K+]e und löst so eine Depolarisation aus. Die Depolarisation hat eine Umkehr des NCX in den Rückwärtsmodus zur Folge, wodurch Ca2+ in die Zelle transportiert wird. Dieser Ca2+-Influx leitet dann [Ca2+]t in OPC-Fortsätze ein, die einen positiven Einfluss auf die lokale MBP-Expression zu haben scheinen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2167
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000021543
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XII, 95 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen