Authors:	Rapp, Steffen
Title:	Genexpressionsanalyse der fötalen Wachstumsfuge des Rindes
Online publication date:	27-Dec-2011
Year of first publication:	2011
Language:	german
Abstract:	Erkrankungen des Skelettapparats wie beispielsweise die Osteoporose oder Arthrose gehören neben den Herz-Kreislauferkrankungen und Tumoren zu den Häufigsten Erkrankungen des Menschen. Ein besseres Verständnis der Bildung und des Erhalts von Knochen- oder Knorpelgewebe ist deshalb von besonderer Bedeutung. Viele bisherige Ansätze zur Identifizierung hierfür relevanter Gene, deren Produkte und Interaktionen beruhen auf der Untersuchung pathologischer Situationen. Daher ist die Funktion vieler Gene nur im Zusammenhang mit Krankheiten beschrieben. Untersuchungen, die die Genaktivität bei der Normalentwicklung von knochen- und knorpelbildenden Geweben zum Ziel haben, sind dagegen weit weniger oft durchgeführt worden. rnEines der entwicklungsphysiologisch interessantesten Gewebe ist die Epiphysenfuge der Röhrenknochen. In dieser sogenannten Wachstumsfuge ist insbesondere beim fötalen Gewebe eine sehr hohe Aktivität derjenigen Gene zu erwarten, die an der Knochen- und Knorpelbildung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde daher aus der Epiphysenfuge von Kälberknochen RNA isoliert und eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Von dieser wurden ca. 4000 Klone im Rahmen eines klassischen EST-Projekts sequenziert. Durch die Analyse konnte ein ungefähr 900 Gene umfassendes Expressionsprofil erstellt werden und viele Transkripte für Komponenten der regulatorischen und strukturbildenden Bestandteile der Knochen- und Knorpelentwicklung identifiziert werden. Neben den typischen Genen für Komponenten der Knochenentwicklung sind auch deutlich Bestandteile für embryonale Entwicklungsprozesse vertreten. Zu ersten gehören in erster Linie die Kollagene, allen voran Kollagen II alpha 1, das mit Abstand höchst exprimierte Gen in der fötalen Wachstumsfuge. Nach den ribosomalen Proteinen stellen die Kollagene mit ca. 10 % aller auswertbaren Sequenzen die zweitgrößte Gengruppe im erstellten Expressionsprofil dar. Proteoglykane und andere niedrig exprimierte regulatorische Elemente, wie Transkriptionsfaktoren, konnten im EST-Projekt aufgrund der geringen Abdeckung nur in sehr geringer Kopienzahl gefunden werden. Allerdings förderte die EST-Analyse mehrere interessante, bisher nicht bekannte Transkripte zutage, die detaillierter untersucht wurden. Dazu gehören Transkripte die, die dem LOC618319 zugeordnet werden konnten. Neben den bisher beschriebenen drei Exonbereichen konnte ein weiteres Exon im 3‘-UTR identifiziert werden. Im abgeleiteten Protein, das mindestens 121 AS lang ist, wurden ein Signalpeptid und eine Transmembrandomäne nachgewiesen. In Verbindung mit einer möglichen Glykosylierung ist das Genprodukt in die Gruppe der Proteoglykane einzuordnen. Leicht abweichend von den typischen Strukturen knochen- und knorpelspezifischer Proteoglykane ist eine mögliche Funktion dieses Genprodukts bei der Interaktion mit Integrinen und der Zell-Zellinteraktion, aber auch bei der Signaltransduktion denkbar. rnDie EST-Sequenzierungen von ca. 4000 cDNA- Klonen können aber in der Regel nur einen Bruchteil der möglichen Transkripte des untersuchten Gewebes abdecken. Mit den neuen Sequenziertechnologien des „Next Generation Sequencing“ bestehen völlig neue Möglichkeiten, komplette Transkriptome mit sehr hoher Abdeckung zu sequenzieren und zu analysieren. Zur Unterstützung der EST-Daten und zur deutlichen Verbreiterung der Datenbasis wurde das Transkriptom der bovinen fötalen Wachstumsfuge sowohl mit Hilfe der Roche-454/FLX- als auch der Illumina-Solexa-Technologie sequenziert. Bei der Auswertung der ca. 40000 454- und 75 Millionen Illumina-Sequenzen wurden Verfahren zur allgemeinen Handhabung, der Qualitätskontrolle, dem „Clustern“, der Annotation und quantitativen Auswertung von großen Mengen an Sequenzdaten etabliert. Beim Vergleich der Hochdurchsatz Blast-Analysen im klassischen „Read-Count“-Ansatz mit dem erstellten EST-Expressionsprofil konnten gute Überstimmungen gezeigt werden. Abweichungen zwischen den einzelnen Methoden konnten nicht in allen Fällen methodisch erklärt werden. In einigen Fällen sind Korrelationen zwischen Transkriptlänge und „Read“-Verteilung zu erkennen. Obwohl schon simple Methoden wie die Normierung auf RPKM („reads per kilo base transkript per million mappable reads“) eine Verbesserung der Interpretation ermöglichen, konnten messtechnisch durch die Art der Sequenzierung bedingte systematische Fehler nicht immer ausgeräumt werden. Besonders wichtig ist daher die geeignete Normalisierung der Daten beim Vergleich verschieden generierter Datensätze. rnDie hier diskutierten Ergebnisse aus den verschiedenen Analysen zeigen die neuen Sequenziertechnologien als gute Ergänzung und potentiellen Ersatz für etablierte Methoden zur Genexpressionsanalyse.rn Apart from cardiovascular diseases and tumors diseases of the skeletal apparatus such as osteoporosis or arthritis belong to the most common human diseases. A better understanding of the development and preservation of bone or cartilage tissue is of particular importance. Previous approaches to identify these relevant genes, their products and interactions based upon the examination of pathological situations. Therefore, the function of many genes is only described in association with diseases. Investigations, which have gene activity in normal development of bone and cartilage forming tissues as a target, have been carried out far less often. rnA particularly interesting tissue in this area is the epiphyseal plate of long bones. In the growth plate of fetal tissue a very high activity of those genes is expected, that are involved in bone and cartilage development. Therefore, in the present study RNA was isolated from the epiphyseal plate of calf bone to construct a cDNA library. Approximately 4000 clones were sequenced as part of a classical EST project. By analyzing approximately 900 genes a comprehensive expression profile could be created. Transcripts for many regulatory and structural components of bone and cartilage development could be identified. In addition to the typical genes, which are involved in bone development many components of embryonic developmental processes are significantly upregulated. Beside the ribosomal proteins, collagens represent about 10% of evaluable sequences, which is the second largest group of genes in the expression profile generated. Especially collagen II alpha 1 was shown to be the highest expressed gene in fetal growth plate by far. Proteoglycans and other low-expressed regulatory elements, such as transcription factors could be found only in very low copy number in the EST project due to the low coverage. But the EST analysis revealed several interesting and previously unknown transcripts, which were investigated in detail. These include transcripts, which could be associated with the locus LOC618319. In addition to the previously described three exon regions an additional exon could be identified in 3'-UTR. In the derived protein that contains at least 121 amino acids, a signal peptide and a transmembrane domain were detected. In conjunction with a possible glycosylation the gene product is classified as a proteoglycan. The structure of this protein is slightly different from other bone and cartilage specific proteoglycans. A possible function of this gene product in the interaction with integrins and cell-cell interaction, but also in signal transduction is conceivable.rnEST sequencing of 4000 cDNA clones can usually cover only a fraction of the possible transcripts of the tissue examined. The methods of "Next Generation Sequencing" allow entirely new ways to analyze complete transcriptomes with a very high coverage. To support the EST data and to significantly extend the amount of data, the transcriptome of the fetal bovine growth plate has been sequenced, both by the Roche-454/FLX and the Illumina Solexa technology. By analyzing approximately 40000 454/FLX and 75 million Illumina sequence reads, procedures for general handling, quality control, data clustering, annotation and quantitation of this large amount of sequence data have been established. The comparison of the high-throughput BLAST analysis in a classic "Read-count" approach with the EST expression profile showed good consistence. Discrepancies between the methods could not be explained methodically in all cases. In some cases, correlations between transcript and read distribution can be seen. The normalization to RPKM ("reads per kilobase transcript per million mappable reads") which is a simple method to improve the accuracy of data could not always resolve systematic errors related by the method of sequencing.rnTherefore, the appropriate normalization of data is of particular importance when comparing data sets generated by different methods.rnThe results discussed in the various analyses show that the new sequencing technologies are a good complement and potential replacement for established methods for gene expression analyses.rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2146
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-29796
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	168 S.
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