Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2137
Authors: Neufurth, Meik
Title: Molekularbiologische Charakterisierung der beiden Untereinheiten des Mega-Hämocyanins der Schnecke Melanoides tuberculata
Online publication date: 22-Dec-2011
Language: german
Abstract: Bei dem 2010 von unserer Arbeitsgruppe entdeckten Mega-Hämocyanin handelt es sich um einen stark abgewandelten Typ des respiratorischen Proteins Hämocyanin, bestehend aus zwei flankierenden regulären Dekameren und einem zentralen Mega-Dekamer. Diese sind aus zwei immunologisch verschiedenen Untereinheiten mit ~400 bzw. ~550 kDa aufgebaut, die in unserer Arbeitsgruppe bereits proteinbiochemisch charakterisiert wurden. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte zudem eine 3D-Rekonstruktion des Oligomers (13,5 MDa) mit einer Auflösung von 13Å erstellt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der Primärstruktur beider Polypeptide bei der Schnecke Melanoides tuberculata (MtH). Es gelang, die cDNAs der beiden Untereinheiten vollständig zu sequenzieren. Die zu typischen Dekameren assemblierende MtH400-Untereinheit umfasst 3445 Aminosäuren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 390 kDa. Nach dem Signalpeptid von 23 Aminosäuren Länge folgen die für Gastropoden-Hämocyanine typischen funktionellen Einheiten FU-a bis FU-h. Insgesamt verfügt die MtH400-Untereinheit über sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen. Die MtH550-Untereinheit, welche mit 10 Kopien das Mega-Dekamer bildet, umfasst 4999 Aminosäuren und besitzt eine theoretische Molekularmasse von 567 kDa. Damit handelt es sich bei dieser Untereinheit um die zweitgrößte jemals bei einem Protein detektierte Polypeptidkette. Die MtH550-Untereinheit besteht aus einem Signalpeptid von 20 Aminosäuren Länge und den typischen Wand-FUs (FU-a bis FU-f). Daran anschließend folgen sechs weitere Varianten der FU-f (FU-f1 bis FU-f6). Die MtH550-Untereinheit verfügt über insgesamt zwölf potentielle N-Glykosylierungsstellen. Anhand der ermittelten Primärstrukturdaten wird klar, dass der auffällig vergrößerte Kragenbereich des Mega-Dekamers aus je 10 Kopien der FU-f1 bis FU-f6 besteht. Die ermittelten Sequenzdaten der beiden MtH-Untereinheiten weisen im Vergleich zu anderen Hämocyanin Sequenzen einige sehr charakteristische Indels sowie unübliche N-Glykosylierungsstellen auf. Es war zudem möglich, anhand einer molekularen Uhr den Entstehungszeitpunkt des Mega-Hämocyanins zu datieren (145 ± 35 MYA). Sowohl die Topologie als auch die berechneten Trennungszeitpunkte des an allen Verzweigungen gut unterstützten Stammbaums stimmen mit den bisher publizierten und auf Hämocyanindaten basierenden molekularen Uhren überein.
Previously our group discovered, in cerithioid snails, an unusually complex type of the respiratory protein hemocyanin. This tridecameric mega-hemocyanin is built from two different types of decamer: two flanking decamers of the typical gastropod hemocyanin type, and a central mega-decamer. Each decamer type is built from a specific subunit: ~400 kDa in case of the regular decamer and ~550 kDa in case of the mega-decamer. The two subunit types have been analyzed biochemically, and furthermore, a cryoEM-based 3D-reconstruction of the oligomer (13.5 MDa) with 13Å resolution was provided.rnThe goal of this work was the elucidation of the primary structure from both subunits of the mega-hemocyanin of Melanoides tuberculata. The cDNAs coding for the two subunits could be completely sequenced. The MtH400-subunit comprises 3445 amino acids and has a molecular mass of 390 kDa as predicted from the sequence. It encompasses a signal peptide (23 amino acids) and the eight typical functional units FU-a to FU-h hitherto observed in molluscan hemocyanins. Moreover, it exhibits six potential attachment sites for N-glycans. In contrast, the MtH550-subunit comprises 4999 amino acids and has a predicted molecular mass of 567 kDa. This is the second largest polypeptide ever reported. It encompasses a signal peptide (20 amino acids) and the adjacent canonical functional units FU-a to FU-f which are assumed to form the cylinder wall of the decamer. Instead of the collar-forming functional units FU-g and FU-h as in the MtH400-subunit, the MtH550-subunit possesses C-terminally six variants of FU-f, termed FU-f1 to FU-f6. It exhibits a total of twelve potential N-glycosylation sites, partially at unusual positions. The different functional units of both subunit types show all structural features required for reversible oxygen binding.rnThe major branches of phylogenetic trees calculated from the now available sequence data are well bootstrap-supported and fit the branching pattern of earlier trees of molluscan hemocyanin. Based on a calculated molecular clock, the phylogenetic origin of mega-hemocyanin could be dated back 145 ± 35 million years.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2137
URN: urn:nbn:de:hebis:77-29703
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 143 S.
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
2970.pdf21.07 MBAdobe PDFView/Open