Authors:	Jefferson, Tamara
Title:	Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics
Online publication date:	16-Dec-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. \r\nIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. \r\nDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.\r\n The zinc-endopeptidases meprin α and β are key players in (patho)physiological processes like inflammation, collagen assembly, and angiogenesis. After their discovery in murine brush border membranes and human intestinal epithelia, more expression loci were identified such as leukocytes, cancer cells, and human skin. Animal models, cell cultures, and biochemical assays indicate functions for meprins in epithelial differentiation, cell migration, matrix remodeling, angiogenesis, connective tissue formation, and immunological processes. However, many of their precise physiological substrates remain elusive.\r\nMass spectrometry based proteomics revealed unique cleavage specificity for acidic amino acid residues in P1´ and identified novel biological substrate candidates. Among 269 extracellular proteins detected in the substrate screen, the amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) emerged as highly confident candidates. \r\nAPP is known to have several cleavage sites mediated by different proteases, resulting in diverse implications. Proteolytic processing of one site refers to the β-secretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) and is the primary step in the development of Alzheimer´s Disease (AD) since toxic Aβ (amyloid β) peptides are released into the extracellular space aggregating to senile plaques. Membrane- anchored meprin β exhibits β-secretase activity as demonstrated in a cell culture system. In FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-based assays, the meprin cleavage efficiency towards Aβ peptides was determined to be 104 higher than BACE1 activity. Moreover, meprin β cleaves the first two amino acids (aa), liberating aminoterminally a glutamate residue which then can be cyclized into pyro-glutamate by the human glutaminyl cyclase. The truncated Aβ peptides are specifically generated only in AD patients. Due to a higher hydrophobicity these peptides reveal greater plaque-forming capacity which distributes a greater toxicity. Until now, there was no protease identified processing at this cleavage site. Generation of meprin mediated N-terminal APP fragments was detected in vitro and in vivo. These N-APP peptides were not toxic to murine and human brain cells although N-APP was previously demonstrated to be a ligand for the death receptor (DR) 6 triggering neuronal degeneration. \r\nADAM10 is proposed to shed the ectodomain of APP in a non-amyloidogenic pathway. In this regard, we could identify the propeptide of ADAM10 as a substrate for meprin β subsequently leading to an increased activation of ADAM10, demonstrated by FRET analyses, as well as in vitro and in vivo approaches. Vice versa ADAM10 was shown to shed meprin β into the extracellular space. Shedding was induced either by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) or the ion carrier A23187, and was blocked by ADAM10 inhibitors. Overall, this thesis revealed a complex proteolytic network in neurophysiology that might be important for the progression of Alzheimer’s Disease.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2126
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-29584
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	40 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen