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Authors: Schneiker, Kerstin
Title: Evaluation von Nukleotidpolymorphismen für die Analyse des hämatopoetischen Spenderchimärismus auf Ebene der cDNA
Online publication date: 16-Dec-2011
Language: german
Abstract: Nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation spielt die Zuordnung hämatopoetischer Zellen zum Spender oder Empfänger für viele transplantationsbezogene Fragestellungen eine wichtige Rolle. Unter anderem ist das Persistieren von dendritischen Zellen des Empfängers, welche allogene T-Zellen des Spenders stimulieren, ein wichtiger Schritt bei der Entstehung der akuten GVHD. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Weiterentwicklung einer Methode angestrebt, die es uns erlaubt, die Zugehörigkeit isolierter hämatopoetischer Zellen dem Spender oder dem Empfänger zuzuordnen (Chimärismusbestimmung) und gleichzeitig Aussagen über das Ursprungsgewebe und den Aktivierungszustand der Zellen machen zu können. Hierfür nutzten wir Einzelbasenpolymorphismen (SNPs). Ziel dieser Arbeit war es, einen Pool von cDNA-kodierten SNPs zu definieren, mit dem auch HLA-identische Geschwister eindeutig unteschieden werden können. \r\nHierfür wurden zunächst aus publizierten Datenbanken solche SNPs ausgewählt, die in kodierenden Genabschnitten konstitutiv und gewebeunabhängig auf expremierten Genen lagen und zugleich eine hohe Heterozygotenfrequenz in der europäischen Population aufwiesen. Anhand dieser Kriterien wurden mittels der NCBI-Datenbank insgesamt eine Anzahl von 208 Polymorphismen auf 150 Genen identifiziert. Anschließend erfolgte die Gestaltung von Primerpaaren zur Amplifikation der SNP-kodierenden cDNA-Abschnitte. Diese mussten mindestens eine Intron/Exon-Grenze überspannen, um genomische DNA in der PCR ausschließen zu können. Mit Hilfe der etablierten PCR-Reaktion wurden die Gene in unterschiedlichen Geweben auf ihre Expression hin überprüft. Für 45 Gene ließ sich sowohl eine entsprechende PCR etablieren als auch deren konstitutive Expression in verschiedenen hämatopoetischen Zellen nachweisen. Zur Detektion der einzelnen SNPs in der Minisequenzierung wurden Minisequenzierungs-Sonden generiert und geprüft. Im Folgenden wurden für PCR und Minisequezierung Multiplex-Reaktionen aus vier bis sechs Reaktionen zusammengestellt. Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen Primerinteraktionen und die unterschiedlichen Basenlängen des PCR-Produktes berücksichtigt.\r\nVon den 45 etablierten Einzelreaktionen waren 30 für den Multiplexansatz geeignet. Unter Anwendung dieser Multiplex-Reaktionen wurden 24 HLA-identische Geschwisterpaare (Spender und Empfänger) getestet. Zur Kontrolle erfolgte zusätzlich eine konventionelle Sequenzierung der SNP-kodierenden Bereiche auf der cDNA der jeweiligen Proben. Mit Hilfe der SNP-Kombinationen und der etablierten Methodik waren wir in der Lage alle 24 untersuchten Geschwisterpaare in zwischen sechs und 18 SNP-Systemen zu unterscheiden. \r\nDie Möglichkeiten, die die Analysen des Chimärismus mittels SNPs auf kodierenden Bereichen der DNA mit sich bringen, liegen nicht nur in der gleichzeitigen Bestimmung der Gewebszugehörigkeit und der Detektion des bestehenden Chimärismus sowie dessen Quantifizierung unter Anwendung einer Real-time-PCR. Vielmehr ermöglicht sie auch eine Aussage über die Genexpression der untersuchten Zelle zu machen. Dies ist insbesondere dann von Interesse, wenn geringe Zellzahlen von aus Gewebe isolierten Zellen zur Verfügung stehen. Die in dieser Arbeit etablierten Ansätze werden derzeit für eine Quantifizierung mittels real-time RCR weiterentwickelt und sollen mittelfristig insbesondere für Untersuchungen des Chimärismus von dermalen und epidermalen dendritischen Zellen der Haut und anderer Zielgewebe der GvHD verwendet werden.\r\n
Assigning residual hematopoietic cells of the recipient after allogene hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) play a crucial role for many questions relating to transplantation. Amongst others, the persistence of recipient-dendritic cells (DC) which stimulate allogene donor T-cells is an important step for developing acute GvHD (Graft-versus-Host-Disease). For this reason we aspired a method which allows us to allocate the isolated cells whether donor or recipient (chimerism) and to make an evidence of the origin tissue and the activity of the cells at the same time.\r Therefore we used single nucleotide polymorphisms (SNPs). Our ambition was to define a pool of cDNA (coding DNA) coding SNPs with which you can differentiate between HLA-identic siblings. For this purpose SNPs from publicized database were selected, which are located on constitutive areas and independent of tissue expressed genes with a high european heterozygosity. \r\nOn the basis of these characteristics we collectively identified 208 polymorphisms on 150 genes. Afterwards we generate the primers to amplify the SNP-coding areas on cDNA. These primers had to contain an Intron to exclude genomic DNA. With the aid of PCR-reactions the genes were tested of their expression on different tissues. On 45 genes we could establish a PCR and we could demonstrate their constitutive expression on hematopoietic cells. For detecting the individual SNPs via minisequencing, primers were designed, tested and arranged in groups of 4 till 6 for multiplex-reactions. For this reason the interaction between the different primers and the length of the nucleotides had to be considered.\r\n30 of the 45 established reactions were suited for multiplex-reactions and tested on HLA-identic siblings (donor and recipient). For controlling we additional achieved conventional sequencing on the SNP-coding areas of the respective tissues. Due to the assortment of the SNPs and the established method we were able to distinguish all 24 analyzed siblings by 6 till 18 SNP-systems.\r\nThere are different opportunities in analyzing the chimerism via SNPs on cDNA. On the one hand we can detect at the same time the belonging of the tissue and the existing chimerism as well as their quantification based on a real-time-PCR. On the other hand you can make a declaration of the individual gene expression of the analyzed cell. This is particularly with regard to few cell counts. \r\nThe established assortments in this dissertation are actually developed further for a quantification via real-time-PCR and shall be used for chimerism-analysis of dermal and epidermal dendritic cells of the dermis and other tissues affected of GvHD.\r\n
DDC: 610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2122
URN: urn:nbn:de:hebis:77-29532
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 103 S.
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