Authors:	Stein, Bettina
Title:	Einfluss von Chromatin-Modulatoren auf Bildung, Reparatur und Mutagenität von DNA-Schäden
Online publication date:	1-Dec-2011
Year of first publication:	2011
Language:	german
Abstract:	Die Entstehung von Mutationen, und somit der erste Schritt der Kanzerogenese, steht in engem Zusammenhang mit der Effektivität der DNA-Reparatur. Werden zur Fehlpaarung neigende (prämutagene) DNA-Schäden, wie z.B. die oxidative Läsion 8-oxoG, zu langsam oder auch fehlerhaft repariert, so führt dies zwangsläufig zu einer Erhöhung der Mutationsrate. Das Zusammenspiel zwischen Schadensentstehung und dessen Reparatur ist somit von großem Interesse. Ein wichtiger Faktor, der dieses Gleichgewicht beeinflussen könnte, ist die Chromatinstruktur, die entscheidend ist für die DNA-Zugänglichkeit.rnrnDie Frage, ob und in welchem Ausmaß der globale Kondensationsgrad des Chromatins die Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden und damit die Entstehung von Mutationen beeinflusst, war der Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit. Um die Chromatinstruktur zu modulieren, wurden zum einen Resveratrol, zum anderen die HDAC-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin A eingesetzt. Resveratrol führt, möglicherweise über eine SIRT1-Aktivierung, zu einem kondensierten und schlecht zugänglichen Chromatin. Die HDAC-Inhibitoren hingegen resultieren durch verstärkte Acetylierung von Histonen in einer global dekondensierten, offenen Chromatinstruktur. Mit Hilfe des Photosensibilisators Ro19-8022 in Kombination mit sichtbarem Licht, UV-B-Strahlung und Wasserstoffperoxid wurden in so veränderten Zellen verschiedene Arten von DNA-Schäden induziert, welche jeweils spezifisch sind für unterschiedliche Reparaturwege. Das Ausmaß induzierter Läsionen sowie deren Reparatur wurde mittels Alkalischer Elution und entsprechenden Reparaturendonukleasen bestimmt. rnrnDie Ergebnisse zeigen eine durch Resveratrol unbeeinflusste Schadensinduktion, andererseits jedoch eine deutliche Verlangsamung der Reparatur verschiedener Arten von DNA- Läsionen (oxidative Läsionen, Cyclobutanpyrimidindimere, Einzelstrangbrüche) und somit auch verschiedener Reparaturwege in AS52-Zellen. Die HDAC-Inhibitoren hingegen verursachen ein erhöhtes Ausmaß induzierter Läsionen, jedoch keine Änderung der Reparaturgeschwindigkeit. Die Entstehung spontaner und induzierter Mutationen zeigt sich durch Resveratrol unbeeinflusst, HDAC-Inhibitoren resultieren in signifikant erniedrigten Mutationsraten in AS52-Zellen. Letzterer Effekt ist durch die beobachteten Einflüsse auf Reparatur und Suszeptibilität in den Zellen nicht erklärbar und bedarf einer mechanistischen Aufklärung. Die durch Resveratrol beobachtete Reparatur-Retardierung wurde mechanistisch weiter untersucht. Durch Inhibierung von SIRT1, einer durch Resveratrol aktivierten Deacetylase, konnte dessen Beteiligung an der Reparaturverlangsamung ausgeschlossen werden. Auch eine Beteiligung von oxidativem Stress, dem MAPK-Signalweg (ERK 1/2, p38) oder p53 konnte ausgeschlossen werden. Die Durchführung der Reparaturversuche mit menschlichen HeLa-Zellen zeigten, dass die durch Resveratrol verursachten Effekte quantitativ stark zelltypabhängig sind. Während die Reparatur in HeLa-Zellen deutlich weniger beeinflusst wird, sind dennoch andere Parameter wie Proliferation und Glutathionspiegel eher stärker verändert wie in AS52-Zellen. Der Mechanismus der durch Resveratrol verursachten Reparaturhemmung bedarf somit weiterer Untersuchungen.rn The generation of mutations and therefore the first step of carcinogenesis is closely linked to the effectiveness of DNA repair. If lesions which tend to mispairing (premutagen) like for example 8-oxoG are repaired slowly or inaccurate this necessarily gives rise to an elevated mutation rate. Therefore the interplay between damage induction and its repair is of great interest. An important factor which could influence this steady state is chromatin structure because of the accessibility to DNA.rnrnThe question if and to what extent global condensation of chromatin influences the generation and repair of DNA lesions and therefore the generation of mutations was the initial point of the thesis. To modulate chromatin structure resveratrol was used on the one hand and the HDAC inhibitors sodium butyrate and trichostatin A on the other hand. Resveratrol results, possibly because of an SIRT1 activation, in a condensed and badly accessible chromatin whereas the HDAC inhibitors lead to an globally decondensed open chromatin structure because of an enhanced acetylation of histons. With the help of the photosensibilisator Ro19-8022 in combination with visible light, UV-B irradiation and hydrogen peroxide DNA lesions were induced in so treated cells, which in each case are specific for different repair pathways. The extent of induced lesions as well as their repair was measured by an alkaline elution assay and appropriate repair endonucleases.rnrnThe results show an unaffected damage induction under the influence of resveratrol but a clearly retarded repair of all types of lesions (oxidative lesions, cyclobutan pyrimidin dimers, single-strand breaks) and thus also of different repair pathways in AS52 cells. The HDAC inhibitors on the other hand caused an increased amount of induced lesions whereas the repair capacity was unchanged. The generation of spontaneous and induced mutations was unaffected by resveratrol but significantly reduced by the HDAC inhibitors. The latter effect can not be explained by the influences on damage induction and repair and still requires a mechanistic elucidation. The repair retardation caused by resveratrol was further studied. The inhibition of SIRT1, a deacetylase activated by resveratrol, could exclude its involvement in slowing down repair. Also an involvement of oxidative stress, the MAPK pathway (ERK 1/2, p38) or p53 could be excluded. The accomplishment of repair experiments in human HeLa cells showed, that the resveratrol effects are quantitatively depending on the cell type. As the repair in HeLa cells is clearly less affected other parameters like proliferation and glutathione levels are changed even stronger than in AS52 cells. The mechanism of reapir retardation caused by resveratrol therefore needs further investigation.rn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2114
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-29385
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	157 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen