Authors:	Reißig, Sonja
Title:	Misregulation of the tumour suppressor gene CYLD drives hyperactivation of T cells leading to intestinal pathology
Online publication date:	10-Nov-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	The tumour suppressor gene cyld is mutated in familial cylindromatosis, an autosomal-dominant condition that predisposes to multiple skin tumours. The deubiquitinase CYLD acts as a negative regulator of NF-κB signaling. To analyse the function of CYLD in vivo we used the CYLDex7/8 mice, which are characterized by loss of the full-length transcript and overexpression of a short splice variant of CYLD (sCYLD). In CYLDex7/8 mice the overexpression of sCYLD results in splenomegaly and lymphadenopathy. Additionally, the B cell population in spleen and lymph nodes is increased at the expense of T cells. Analysis of CYLDex7/8 T cells showed a significant reduction of CD4 single positive (SP) and CD8 SP T cells in the thymus and in the periphery. By investigating the impact of sCYLD in TCR signaling in thymocytes, we could demonstrate that sCYLD partially inhibited the activation of Zap70 and thereby negatively regulated TCR signaling. In vitro as well as in vivo we could show that CD4+ T cells displayed a hyperactive phenotype, proliferated to a better extent than WT cells and expressed high amounts of inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-17A. Western Blots of steady state thymocytes and peripheral CD4+ T cells were performed, showing that the noncanonical pathway was highly upregulated visualized by the expression levels of RelB and p100 leading to a hyperactive phenotype of CD4+ T cells. In order to investigate the contribution of sCYLD in positive and negative selection in the thymus in vivo, the HY-TCR transgene (HYtg) was crossed to CYLDex7/8 mice. The analysis of CYLDex7/8 HYtg males revealed an increase in CD4+CD8+ DP as well as in CD8+ SP thymocytes, suggesting a less pronounced negative selection in CYLD mutant mice compared to HYtg control mice. Interestingly, the impaired negative selection in the thymus was accompanied by a strong colitis phenotype at early ages (4 weeks). Since medullary TECs (mTECs) play an important role in the late stage of T cell development by negatively selecting autoreactive thymocytes, the levels of mTECs in the medullary compartment was investigated. Of note, low numbers of mTECs were observed, combined with decreased expression levels of the mTEC markers UEA-1, keratin-5, claudin-3 and claudin-4. The reduction of mTECs in the medullary compartment could explain the inflammatory phenotype of CD4+ T cells in CYLDex7/8 mice leading to the severe intestinal pathology observed in these mice. Taken together, these results show an important role of sCYLD in T cell development and function as well as in NF-кB signaling of T cells. Das Tumorsuppressor Gen cyld ist mutiert in Patienten mit familiärer Zylindromatose, was zu einer autosomal-dominant vererbten Prädisposition für multiple Tumore der Haut führt. Die Deubiquitinase CYLD ist ein negativer Regulator des NF-κB Signalweges und hemmt die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, welcher an Entzündungsreaktion, Immunantwort, Apoptose und Onkogenese beteiligt ist. Um die in vivo Funktion von CYLD zu untersuchen, wurde der Mausstamm CYLDex7/8 analysiert, welcher ausschließlich eine natürlich vorkommende Spleißvariante des cyld Gens (sCYLD) überexprimiert. Als Kontrollen dienten CYLDko und WT Mäuse. In CYLDex7/8 Mäusen führte die Überexpression von sCYLD zu vergößerten sekundären lymphatischen Organen wie der Milz und den peripheren Lymphknoten. Dieser Phänotyp resultierte aus einer drastischen Ansammlung von B Zellen, wohingegen die Anzahl von T Zellen stark reduziert war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Gesamtzellzahl von CD4 SP und CD8 SP T Zellen sowohl im Thymus als auch in der Milz signifikant verringert war. Um die Rolle von sCYLD im TCR Signalweg der Thymozyten zu charakterisieren wurde mittels Western Blot der Signalweg untersucht. Inter-essanterweise konnte gezeigt werden, dass sCYLD die Aktivierung und Phosphorylierung der Proteinkinase Zap70 herunterreguliert, und somit den TCR Signalweg in Thymozyten negativ reguliert. Des Weiteren konnte sowohl in vitro als auch in vivo demonstriert werden, dass sCYLD überexprimierende CD4+ T Zellen einen hyperaktiven Phänotyp besitzen, eine erhöhte Proliferationskapazität aufweisen und vermehrt inflammatorische Zytokine wie IL-6 und IL-17A produzieren. Da bekannt ist, dass CYLD ein Inhibitor des NF-κB Signalweges ist, wurde mit Hilfe von RT PCR und Western Blot die Rolle von sCYLD in diesem Signalweg untersucht. In CYLDex7/8 Thymozyten und peripheren CD4+ T Zellen konnte eine erhöhte Aktivität des alternativen NF-κB Signalweges nachgewiesen werden, wohingegen der klassische NF-κB Signalweg keine Veränderung im Vergleich zu den Kontrollen aufwies. Um den Einfluss von sCLYD auf die positive und negative Selektion in vivo im Thymus zu untersuchen, wurden CYLDex7/8 Mäuse mit HY TCR transgenen Mäusen verpaart. Die Analyse der HYtg CYLDex7/8 Männchen zeigte eine erhöhte Anzahl an CD4+CD8+ DP und CD8+ SP Thymozyten, was auf einen Defekt in der negativen Selektion von Thymozyten hinweist. Interessanterweise entwickelten HYtg CYLDex7/8 Männchen im Alter von 4 Wochen zusätzlich eine spontane Inflammation des Darmes.\r\nEpithelzellen der thymischen Medulla (mTECs) spielen eine essentielle Rolle in der Entwicklung zentraler Toleranz, indem sie für die Eliminierung autoreaktiver T Zellen während der späten T Zell Entwicklung im Thymus verantwortlich sind. Untersuchungen der mTECs in CYLDex7/8 Mäusen zeigten eine starke Reduktion dieser Zellpopulation im Thymus. Die Reduktion der mTECs in CYLDex7/8 Thymi könnte den inflammatorischen Phänotyp der CD4+ T Zellen erklären und somit die Entwicklung der spontanen intestinalen Pathologie. In den experimentellen Analysen der CYLDex7/8 T Zellen konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von sCLYD in T Zellen eine wichtige Rolle in deren Entwicklung und Regulierung spielt und essentiell für die Aktivierung des alternativen NF-κB Signalweges ist.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2103
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-29186
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	106 S.
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