Authors:	Fetz, Verena
Title:	Identifizierung chemischer Transportinhibitoren zur Modulation (patho)biologischer Genprodukte
Online publication date:	3-Aug-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen und Makromolekülen unterliegt in Eukaryoten einer strengen Regulation. Insbesondere erlaubt die Kompartimentierung eukaryotischer Zellen in Zellkern und Zytoplasma den simultanen Ablauf räumlich getrennter biochemischer Reaktionen, und damit die unabhängige Regulation zellulärer Programme. Da trotz intensiver Forschungsbemühungen bis dato die molekularen Details sowie die (patho)biologische Bedeutung von Kern-Zytoplasma-Transportprozessen noch immer nicht vollkommen verstanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Identifizierung von chemischen Transportinhibitoren gelegt. Das zu diesem Zweck entwickelte Translokations-Biosensor-System basiert auf der Kombination von autofluoreszierenden Proteinen, sowie spezifisch ausgewählten Kernexport- und Kernimportsignalen. Nach Etablierung geeigneter Zellmodelle, die effizient und stabil die Translokations-Biosensoren exprimieren, wurde die 17 000 Substanzen umfassende Bibliothek der ChemBioNet-Initiative nach Kernexportinhibitoren mittels einer Fluoreszenzmikroskopie-basierten Hochdurchsatzanalyse-Plattform durchmustert. Zunächst wurden Translokations-Algorithmen, welche eine zuverlässige automatisierte Erkennung von Zellkern und Zytoplasma erlauben, optimiert. Im Folgenden konnten acht neue niedermolekulare Kernexport-Inhibitoren identifiziert werden, die sich in der Stärke, der Geschwindigkeit, sowie in der Beständigkeit der vermittelten Inhibition unterscheiden. Die Aktivität der Inhibitoren konnte auf den isolierten nukleären Exportsignalen (NES) von HIV-1 Rev und Survivin als auch auf den entsprechenden Volllängeproteinen mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie durch umfassende in vitro und biochemische Methoden bestätigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Einheiten der Inhibitoren wurden homologe Substanzen auf Ihre Aktivität hin getestet. Dabei konnten für die Aktivität wichtige chemische Gruppen definiert werden. Alle Substanzen stellen neue Inhibitoren des Crm1-abhängigen Exports dar und zeigen keine nachweisbare NES-Selektivität. Interessanterweise konnte jedoch eine zytotoxische und Apoptose-induzierende Wirkung auf verschiedene Krebszellarten festgestellt werden. Da diese Wirkung unabhängig vom p53-Status der Tumorzellen ist und die Inhibitoren C3 und C5 die Vitalität nicht-maligner humaner Zellen signifikant weniger beeinträchtigen, wurden diese Substanzen zum internationalen Patent angemeldet. Da der nukleäre Export besonders für Tumorzellen einen wichtigen Überlebenssignalweg darstellt, könnte dessen reversible Hemmung ausgenutzt werden, um besonders in Kombination mit gängigen Krebstherapien eine therapeutisch relevante Tumorinhibition zu erzeugen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der neuen Exportinhibitoren ist auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu sehen, da auch die Aktivität des essentiellen HIV-1 Rev-Proteins inhibiert wird. Zusätzlich konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass der zelluläre Kofaktor des Crm1-abhängigen Exports des HIV-1 Rev-Proteins, die RNA-Helikase DDX3, ein eigenes NES enthält. Der Nachweis einer direkten Interaktion des HIV-1 Rev- mit dem DDX3-Protein impliziert, dass multiple Angriffstellen für chemische Modulatoren hinsichtlich einer antiviralen Therapie gegeben sind. Da die Vielfalt des chemischen Strukturraums es unmöglich macht diesen experimentell vollständig zu durchmustern, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Naturstoffe als vielversprechende Wirkstoffquelle untersucht. Um zukünftig umfassend bioaktive Substanzen aus diesen hochkomplexen Stoffgemischen experimentell identifizieren zu können, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Hochdurchsatzanalyse-Plattform am Mainz Screening Center (MSC) etabliert. Damit konnte bereits ein weiterer, bisher unbekannter Exportinhibitor aus Cyphellopsis anomala identifiziert werden. Neben einer Anwendung dieser Substanz als chemisches Werkzeug zur Aufklärung der Regulation von Transportvorgängen, stellt sich auch die evolutionsbiologisch relevante Frage, wie es dem Pilzproduzenten gelingt die Blockierung des eigenen Kernexports zu umgehen. Weiterführende Projekte müssen sich neben der Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen der gefundenen Substanzen mit der Identifizierung spezifischer chemischer „Funktionseinheiten“ beschäftigen. Neben einem verbesserten mechanistischen Verständnis von Transportvorgängen stellen die erarbeiteten Transportinhibitoren Vorstufen zur Weiterentwicklung möglicher Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Technologie-Plattform und molekularen Werkzeuge stellen darüber hinaus eine wichtige Voraussetzung dar, um eine systematische Suche nach möglichen Wirkstoffen im Forschungsfeld der „Chemischen Biomedizin“ voranzutreiben. In eukaryotes the intracellular localization of proteins and macromolecules is tightly regulated. The compartmentalization of eukaryotic cells into nucleus and cytoplasm allows the simultaneous flow of biochemical reactions and thus independent regulation of cellular programs. As the molecular details and (patho)biological relevance of nucleocytoplasmic transport remain unsolved, despite intensive effort in investigation, it was the aim of this thesis to identify chemical transport inhibitors. The translocation biosensor system is based on a combination of autofluorescent proteins and specific nuclear localization and export signals. This system was specifically developed to identify compounds interfering with nuclear transport. For screening the 17 000 compounds of the ChemBioNet collection, cell lines efficiently and stably expressing the translocation biosensors were established. Evaluation of inhibitory effect was performed using a microscope based high throughput platform. Translocation algorithms were optimized for a reliable and automated analysis of nucleus and cytoplasm. Eight novel low molecular weight compounds inhibiting nuclear export were identified. Those compounds differ in speed and consistency of mediated inhibition. The novel inhibitors show activity on isolated nuclear export signals (NES) of HIV-1 Rev and Survivin as well as on the respective full length proteins, as proven by microinjection experiments and extensive in vitro and biochemical methods. In order to define functional units of these inhibitors, homologous compounds were tested for activity. Chemical groups important for activity were identified. All compounds are inhibitors of Crm1-dependent nuclear export, without possessing any NES selectivity. Interestingly a cytotoxic and apoptosis-inducing effect on several cancer cells was discovered. This effect was independent of p53-status of the tumor cells. As the inhibitors C3 und C5 significantly less affect viability of non-malignant human cells, those compounds were applied for international patent. Nuclear export is an essential survival pathway for tumor cells. Thus its reversible inhibition could be used to create a therapeutically relevant tumor inhibition in combination with current cancer therapeutics. Infectious disease is another possible field of application of the novel export inhibitors, as HIV-1 Rev activity is also inhibited. Additionally it was shown in this thesis, that DDX3, a cellular cofactor of Crm1-dependent export of HIV-1 Rev, has an internal NES. The confirmation of a direct interaction between HIV-1 Rev and DDX3 implies, that there are multiple areas of attack for chemical modulators concerning antiretroviral therapy. rnDue to its diversity, it is not possible to screen the whole chemical space in an experiment. Thus, natural compounds were tested as a promising source of active agents in this thesis. For identifying bioactive compounds from complex compound mixtures in the future, a microscope based high throughput platform was established at the Mainz Screening Center (MSC). Therewith, a novel to date unknown export inhibitor was identified from Cyphellopsis anomala. Beside using this compound as a chemical tool for elucidating the regulation of transport processes the question remains, in which way the fungal producer avoids inhibition of its own nuclear export. Continuative projects have to elucidate the molecular mechanism of action of the novel compounds but also their functional units have to be identified. Beside an improved mechanistic understanding, the novel transport inhibitors may be precursors for further development as potential therapeutics. The technology platform and the molecular tools established in this thesis are prerequisite for systematically search for novel active substances in the field of ‘chemical biology’.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2090
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31994
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	219 S.
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