Authors:	Schloßmacher, Ute
Title:	The relevance of the silica metabolizing enzyme silicatein-alpha to biomineralization and the formation of biogenic silica in siliceous sponges
Online publication date:	25-Jul-2012
Year of first publication:	2012
Language:	english
Abstract:	Die technische Silikatproduktion erfordert in der Regel hohe Temperaturen und extreme pH-Werte. In der Natur hingegen haben insbesondere Kieselschwämme die außergewöhnliche Fähigkeit, ihr Silikatskelett, das aus einzelnen sogenannten Spiculae besteht, enzymatisch mittels des Proteins Silicatein zu synthetisieren. rnIm Inneren der Spiculae, im zentralen Kanal, befindet sich das Axialfilament, welches hauptsächlich aus Silicatein-α aufgebaut ist. Mittels Antikörperfärbungen und Elektronenmikroskopischen Analysen konnte festgestellt werden, dass Silicatein in mit Kieselsäure-gefüllten Zellorganellen (silicasomes) nachzuweisen ist. Mittels dieser Vakuolen kann das Enzym und die Kieselsäure aus der Zelle zu den Spiculae im extrazellulären Raum befördert werden, wo diese ihre endgültige Länge und Dicke erreichen. Zum ersten Mal konnte nachgewiesen werden, dass rekombinant hergestelltes Silicatein-α sowohl als Siliciumdioxid-Polymerase als auch Siliciumdioxid-Esterase wirkt. Mittels Massenspektroskopie konnte die enzymatische Polymerisation von Kieselsäure nachverfolgt werden. Durch Spaltung der Esterbindung des künstlichen Substrates Bis(p-aminophenoxy)-dimethylsilan war es möglich kinetische Parameter der Siliciumdioxid-Esterase-Aktivität des rekombinanten Silicateins zu ermitteln.rnZu den größten biogenen Silikatstukuren auf der Erde gehören die Kieselnadeln der Schwammklasse Hexactinellida. Nadelextrakte aus den Schwammklassen Demospongien (S. domuncula) und Hexactinellida (M. chuni) wurden miteinander verglichen um die potentielle Existenz von Silicatein oder Silicatein-ähnliche Molekülen und die dazu gehörige proteolytischen Aktivität nachzuweisen. Biochemische Analysen zeigten, dass das 27 kDA große isolierte Polypeptid in Monoraphis mehrere gemeinsame Merkmale mit den Silicateinen der Demospongien teilt. Dazu gehören die Größe und die Proteinase-Aktivität. rnUm die Frage zu klären, ob das axiale Filament selbst zur Formbildung der Skelettelemente beiträgt, wurde ein neues mildes Extraktionsverfahren eingeführt. Dieses Verfahren ermöglichte die Solubilisierung des nativen Silicateins aus den Spiculae. Die isolierten Silicateine lagen als Monomere (24 kDa) vor, die Dimere durch nicht-kovalente Bindungen ausbildeten. Darüber hinaus konnten durch PAGE-Gelelektrophorese Tetramere (95 kDa) und Hexamere (135 kDa) nachgewiesen werden. Die Monomere zeigten eine beträchtliche proteolytische Aktivität, die sich während der Polymerisationsphase des Proteins weiter erhöhte. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (TEM) konnte die Assemblierung der Proteine zu filamentartigen Strukturen gezeigt werden. Die Selbstorganisation der Silicatein-α-Monomeren scheint eine Basis für Form- und Musterbildung der wachsenden Nadeln zu bilden.rn Um die Rolle des kürzlich entdeckten Proteins Silintaphin-1, ein starker Interaktionspartner des Silicatein-α, während der Biosilifizierung zu klären, wurden Assemblierungs-Experimente mit den rekombinanten Proteinen in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurde deren Effekt auf die Biosilikatsynthese untersucht. Elektronenmikroskopische Analysen ergaben, dass rekombinantes Silicatein-α zufällig verteilte Aggregate bildet, während die Koinkubation beider Proteine (molekulares Verhältnis 4:1) über fraktal artige Strukturen zu Filamenten führt. Auch die enzymatische Aktivität der Silicatein-α-vermittelte Biosilikatsynthese erhöhte sich in Gegenwart von Silintaphin-1 um das 5,3-fache. rn Industrial production of silica requires usually high temperature conditions and extreme pH. Siliceous sponges have the exceptional ability to synthesize their siliceous skeleton enzymatically via the protein silicatein under physiological conditions. In the central canal of spicules the axial filament is situated, which is composed mainly of silicatein.rnIt is found that silicatein exists in silica-filled cell organelles (silicasomes) that transport the enzyme to the spicules. For the first time it is shown that recombinant silicatein-α acts as a silica polymerase and also as a silica esterase. The enzymatic polymerization of silicic acid follows a distinct course, which was visualized by mass spectroscopy. Following the cleavage of the ester-like bond in the artificial substrate bis(p-aminophenoxy)-dimethylsilane by the recombinant silicatein, the kinetic parameters for silica esterase activity are evaluated. rnThe sponge class Hexactinellida also forms siliceous spicules which are the largest biogenic silica structures on earth. Spicule extracts from S. domuncula and M. chuni are compared and the potential existence of silicatein, or silicatein-like molecules and the potential proteolytic activity of the silicateins in hexactinellids are approached. The results indicate that the isolated 27•kDa polypeptide in Monorhaphis has several characteristics in common with the silicateins found in demosponges like the size, the post-translational modifications and the proteinase activity. rnIn order to approach the question whether it is the axial filament itself, which contributes to the shape formation of the spicules a new mild extraction procedure is introduced. This procedure allows the solubilization of native silicateins from the silica shell and immediately yields monomeric (24kDa) protein, which readily forms dimers through non-covalent linkages. Furthermore polymerization to tetramers (95 kDa) and hexamers (135 kDa) can be demonstrated. The monomers show a considerable proteolytic activity that increases during the polymerization phase of the protein. It is proposed that the basic self-assembly of the silicatein-α monomers provides the general platform for the shape and pattern formation of growing spicules. rnTo clarify the role of the newly identified protein silintaphin-1, a strong interactor of silicatein- α, during the aggregation process the re-assembly experiments are performed with recombinant silicatein-α and recombinant silintaphin-1 at different stoichiometric ratios in vitro. Additionally the effect on the biosilica synthesis is evaluated. Whereas recombinant silicatein-α reaggregates to randomly organized structures, co-incubation of both proteins (molecular ratio 4 : 1) resulted in synthetic filaments via fractal-like patterned self-assemblies, as observed by electron microscopy. Owing to the concerted action of both proteins, the enzymatic activity of silicatein-α strongly increased by 5.3-fold. rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2084
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31892
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	133 S.
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