Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2080
Authors: May, Sylvia
Title: Functional characterisation of in vitro synthesised G-protein coupled receptors in polymersomes
Online publication date: 24-Jul-2012
Language: english
Abstract: Membrane proteins play an indispensable role in physiological processes. It is, therefore, not surprising that many diseases are based on the malfunction of membrane proteins. Hence membrane proteins and especially G-protein coupled receptors(GPCRs)- the largest subfamily- have become an important drug target. Due to their high selectivity and sensitivity membrane proteins are also feasible for the detection of small quantities of substances with biosensors. Despite this widespread interest in GPCRs due to their importance as drug targets and biosensors there is still a lack of knowledge of structure, function and endogenous ligands for quiet a few of the previously identified receptors.rnBottlenecks in over- expression, purification, reconstitution and handling of membrane proteins arise due to their hydrophobic nature. Therefore the production of reasonable amounts of functional membrane proteins for structural and functional studies is still challenging. Also the limited stability of lipid based membrane systems hampers their application as platforms forrnscreening applications and biosensors.rnIn recent years the in vitro protein synthesis became a promising alternative to gain better yields for expression of membrane proteins in bio-mimetic membrane systems. These expression systems are based on cell extracts. Therefore cellular effects on protein expression are reduced. The open nature of the cell-free expression systems easily allows for the adjustment of reactionrnconditions for the protein of interest. The cell-free expression in the presence of bio-mimetic membrane systems allows the direct incorporation of the membrane proteins and therefore skips the time-consuming purification and reconstitution processes. Amphiphilic block-copolymers emerged as promising alternative for the less stable lipid-based membrane systems. They, likernlipids, form membraneous structures in aqueous solutions but exhibit increased mechanical and chemical stability.rnThe aim of this work was the generation of a GPCR-functionalised membrane system by combining both promising alternatives: in vitro synthesis and polymeric membrane systems. This novel platform should be feasible for the characterisation of the incorporated GPCR. Immunodetection of Dopamine receptor 1 and 2 expressed in diblock- and triblock-polymersomes demonstrated the successful in vitro expression of GPCRs in polymeric membranes. Antibodyrnbinding studies suggested a favoured orientation of dopamine receptors in triblockpolymersomes.rnA dopamine-replacement assay on DRD2-functionalised immobilised triblockpolymersomes confirmed functionality of the receptor in the polymersomes. The altered binding curve suggests an effect of the altered hydrophobic environment presented by the polymer membrane on protein activity.
Membranproteine spielen eine wichtige Rolle in physiologischen Prozessen. Daher ist es nicht verwunderlich, dass Fehlfunktionen von Membranproteinen h¨aufig Krankheitsbildern zugrunde liegen. Dies erklärt auch das große wissenschaftliche Interesse an Membranproteinen und speziell an G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR), der größten Subfamilie der Membranproteine.rnGPCRs stellen daher ein herausragendes Target für die pharmazeutische Wirkstoffentwicklung dar. Aufgrund ihrer hohe Selektivität und Sensitivität sind Membranproteine auch für die Detektion geringster Stoffmengen mittels Biosensoren sehr interessant. Trotz diesem großen Interesse an GPCRs und ihrer wachsenden Bedeutung als Angriffspunkte neuer Medikamente, ist es noch nicht gelungen Struktur, Funktion und endogene Liganden aller bekannten Rezeptorenrnvollständig aufzuklären. Dies liegt an der hydrophoben Natur der Membranproteine und den damit verbundenen Schwierigkeiten bei Überexpression, Aufreinigung, Rekonstitution und Handhabung. Auch die geringe Stabilität Lipid basierter Membransysteme als Plattform für Screeningsysteme und Biosensoren bereitet Schwierigkeiten für industrielle Anwendungen.rnIn den letzten Jahren wurde die in vitro Synthese von Proteinen zu einer interessanten Alternative, um Membranproteine mit höheren Ausbeuten in biomimetischen Membransystemen herzustellen. Hierfür werden Membranproteine in Gegenwart von Lipidvesikeln oder planaren Membransystemen mit Hilfe von Zellextrakten synthetisiert. Diese zellfreie Methode reduziert zelluläre Einflüsse auf die Proteinausbeute und erleichtert die Anpassung der Expressionsbedingungen. Die direkte Proteinsynthese in Gegenwart biomimetischer Membranen erspart außerdem langwierige Aufreinigungs- und Rekonstituierungsprozesse. rnAuch für die empfindlichen lipidischen Systeme wurde eine vielversprechende Alternative gefunden. Amphiphile Block-Copolymere zeigen in wässrigen Lösungen ähnliches membranbildendes Verhalten wie Lipide.rnAllerdings weisen diese bessere Eigenschaften bezüglich Stabilität und Widerstandskraft auf.rnZiel dieser Arbeit war es, durch die innovative Kombination von in vitro Synthese und Block-Copolymer basierten Membransystemen ein GPCR-funktionalisiertes Membransystem zu entwickeln, welches zur Charakterisierung von GPCRs genutzt werden kann. Die in vitro Expressionrnder GPCRs, Dopamin Rezeptor 1 (DRD1) und 2 (DRD2), im polymeren Membransystemrnwurde mittels Immunodetektion nachgewiesen. Als polymeres Membransystem wurdenrnDiblock- sowie Tribock-Polymersome verwendet, wobei Anitkörper-Bindungsstudien auf eine bevorzugte Orientierung der Rezeptoren in Triblock-Polymersomen hinwiesen. Die Funktionalität des DRD2 wurde durch einen Liganden-Austausch-Assay auf immobilisierten DRD2-funktionalisierten Triblock-Polymersomen nachgewiesen, wobei eine Verschiebung der Bindungskurvernim Vergleich zu zellulären Systemen auf einen Einfluss der modifizierten Proteinumgebung hinweist.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2080
URN: urn:nbn:de:hebis:77-31846
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 90 S.
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