Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2065
Authors: Quiros Barrantes, Steve
Title: Mechanistic study of cell death induction by O 6-methylating agents, focusing on the role of homologous recombination as a molecular target for sensitization of tumor cells to chemotherapeutic alkylating agents
Online publication date: 11-Jul-2012
Language: english
Abstract: Chemotherapeutic SN1‑methylating agents are important anticancer drugs. They induce several covalent modifications in the DNA, from which O6‑methylguanine (O6MeG) is the main toxic lesion. In this work, different hypotheses that have been proposed to explain the mechanism of O6MeG‑triggered cell death were tested. The results of this work support the abortive processing model, which states that abortive post‑replicative processing of O6MeG‑driven mispairs by the DNA mismatch repair (MMR) machinery results in single‑strand gaps in the DNA that, upon a 2nd round of DNA replication, leads to DNA double‑strand break (DSB) formation, checkpoint activation and cell death. In this work, it was shown that O6MeG induces an accumulation of cells in the 2nd G2/M‑phase after treatment. This was accompanied by an increase in DSB formation in the 2nd S/G2/M‑phase, and paralleled by activation of the checkpoint kinases ATR and CHK1. Apoptosis was activated in the 2nd cell cycle. A portion of cells continue proliferating past the 2nd cell cycle, and triggers apoptosis in the subsequent generations. An extension to the original model is proposed, where the persistence of O6MeG in the DNA causes new abortive MMR processing in the 2nd and subsequent generations, where new DSB are produced triggering cell death. Interestingly, removal of O6MeG beyond the 2nd generation lead to a significant, but not complete, reduction in apoptosis, pointing to the involvement of additional mechanisms as a cause of apoptosis. We therefore propose that an increase in genomic instability resulting from accumulation of mis‑repaired DNA damage plays a role in cell death induction. Given the central role of DSB formation in toxicity triggered by chemotherapeutic SN1‑alkylating agents, it was aimed in the second part of this thesis to determine whether inhibition of DSB repair by homologous recombination (HR) or non‑homologous end joining (NHEJ) is a reasonable strategy for sensitizing glioblastoma cells to these agents. The results of this work show that HR down‑regulation in glioblastoma cells impairs the repair of temozolomide (TMZ)‑induced DSB. HR down‑regulation greatly sensitizes cells to cell death following O6‑methylating (TMZ) or O6‑chlorethylating (nimustine) treatment, but not following ionizing radiation. The RNAi mediated inhibition in DSB repair and chemo‑sensitization was proportional to the knockdown of the HR protein RAD51. Chemo‑sensitization was demonstrated for several HR proteins, in glioma cell lines proficient and mutated in p53. Evidence is provided showing that O6MeG is the primary lesion responsible for the increased sensitivity of glioblastoma cells following TMZ treatment, and that inhibition of the resistance marker MGMT restores the chemo‑sensitization achieved by HR down‑regulation. Data are also provided to show that inhibition of DNA‑PK dependent NHEJ does not significantly sensitized glioblastoma cells to TMZ treatment. Finally, the data also show that PARP inhibition with olaparib additionally sensitized HR down‑regulated glioma cells to TMZ. Collectively, the data show that processing of O6MeG through two rounds of DNA replication is required for DSB formation, checkpoint activation and apoptosis induction, and that O6MeG‑triggered apoptosis is also executed in subsequent generations. Furthermore, the data provide proof of principle evidence that down‑regulation of HR is a reasonable strategy for sensitizing glioma cells to killing by O6‑alkylating chemotherapeutics.
SN1‑methylierende Agenzien sind wichtige Antikrebsmedikamente. Sie induzieren mehrere kovalente Modifikationen in der DNA, wobei O6‑Methylguanin (O6MeG) die wichtigste toxische Läsion ist. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Hypothesen getestet, die vorgeschlagen worden sind, um den Mechanismus der O6MeG‑ausgelöste Zelltod zu erklären. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern das Abortiv‑Verarbeitungs Modell, welches behauptet, dass die abortive post‑replikative Verarbeitung von O6MeG‑verursachte Fehlpaarungen durch die Basen‑Fehlpaarungs‑Reparatur (MMR) Einzelstrang‑Lücken in der DNA induziert, die bei einer zweiten Runde der DNA‑Replikation zu eingestürzten Replikationsgabeln, DNA‑Doppelstrangbrüchen (DSB) Bildung, G2 Checkpoint Aktivierung und Zelltod führen. Weiterhin wurde gezeigt, dass O6MeG eine Ansammlung von Zellen in der 2. G2/M‑Phase nach der Behandlung induziert. Dies wurde durch eine Erhöhung der DSBs in der 2. S/G2/M‑Phase und durch Aktivierung der Checkpointkinasen ATR und CHK1 begleitet. Apoptose wurde in der 2. Zellzyklus aktiviert. Ein Teil der Zellpopulation proliferierte weiter an dem zweiten Zellzyklus vorbei und auslöste Apoptose in den nachfolgenden Generationen. Daher wird eine Erweiterung des ursprünglichen Modells vorgeschlagen, bei der die Persistenz von O6MeG in der DNA neue abortive MMR Verarbeitung in den zweiten und den nachfolgenden Generationen verursacht, die neue DSB produzieren, deren Toxizität auslösen. Interessanterweise verursacht die Entfernung von O6MeG, zu Zeitpunkten in denen behandelte Zellen jenseits der 2. Generation sind, einer signifikanten aber nicht vollständigen Reduktion der Apoptose. Dieses Ergebnis weist auf die Beteiligung von anderen zusätzlich Mechanismen, als eine Ursache der Apoptose. Wir schlagen daher vor, dass eine Erhöhung in der genomischen Instabilität, aufgrund der Ansammlung von falsch reparierten DNA‑Schäden, eine Rolle bei dem Zelltod spielt. Angesichts der zentralen Rolle der DSB Bildung bezüglich der Toxizität, die von SN1‑methylierender Chemotherapeutika ausgelöst wird, zielte der zweite Teil dieser Arbeit darauf ab, festzustellen, ob die Hemmung der durch Homologe Rekombination (HR) oder Nicht‑Homologe Endverknüpfung (NHEJ) DSB‑Reparatur, eine plausibel Strategie zur Sensibilisierung von Glioblastom‑Zellen gegenüber O6‑Alkylantien ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass HR‑Herabregulierung in Glioblastomzellen die Reparatur von Temozolomid (TMZ)‑induzierten DSB beeinträchtigt. HR‑Herabregulierung sensibilisiert Zellen für den Zelltod nach O6‑methylierender (TMZ) oder O6‑chlorethylierender (Nimustin) Behandlung, aber nicht nach Bestrahlung mit ionisierender Strahlung. Die RNAi‑ vermittelte Hemmung der DSB‑Reparatur und die Chemo‑Sensibilisierung waren proportional zum Knockdown des HR‑Proteins RAD51. Die Chemo‑Sensibilisierung konnte für mehrere wichtige HR‑Proteine, in Gliomzelllinien mit funktionellen und mutierten p53, nachgewiesen werden. Es wurde auch gezeigt, dass O6MeG die primäre Läsion verantwortlich für die erhöhte Empfindlichkeit von Glioblastomzellen nach einer TMZ Behandlung ist, und dass die Hemmung der Resistenzmarker MGMT eine plausibel Strategie für die Wiederherstellung der durch HR‑Herabregulierung erreichte Chemo‑Sensibilisierung darstellt. Ebenfalls zeigen die Daten, dass die Inhibition von DNA‑PK abhängigen NHEJ nicht zu einer signifikanten Sensibilisierung von Glioblastomzellen nach einer TMZ Behandlung führt. Weiterhin wurde es auch gezeigt, dass PARP‑Hemmung mit Olaparib HR‑Herabregulierte Gliomzellen gegenüber TMZ zusätzlich sensibilisiert. Insgesamt wird es gezeigt, dass die Verarbeitung von O6MeG über zwei Runden der DNA‑Replikation für DSB Bildung, Checkpoint‑Aktivierung und Apoptose‑Induktion erforderlich ist, und dass O6MeG‑ausgelöste Apoptose auch in den nachfolgenden Generationen ausgeführt wird. Darüber hinaus bieten die Daten proof‑of‑principle Beweise dafür, dass HR‑Herabregulierung eine sinnvolle Strategie zur Sensibilisierung von Gliomzellen für den Zelltod durch O6‑alkylierende Chemotherapeutika ist.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2065
URN: urn:nbn:de:hebis:77-31656
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 148 S.
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