Authors:	Sieber, Sebastian
Title:	Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout
Online publication date:	11-Jul-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn The human gene human giant larvae (hugl) is a homolog of the highly conserved Drosophila gene lethal giant larvae (lgl), which holds the function of a neoplastic tumor suppressor and polarity regulator in epithelial cells. A loss or reduced expression of both homologues of the gene, hugl-1 and hugl-2, is associated with the occurrence and progression of various epithelial tumors, including malignant melanoma and tumors in the breast, colon or lungs. The exact function of the homologues Hugl-1 and Hugl-2 regarding the regulation and maintenance of epithelial cell polarity as well as their role in the genesis of human tumors is largely unknown. Also completely unknown is the importance of Hugl-1 and Hugl-2 as regulators of polarity for formation and maintenance of T cell morphology and function. The aim of this study was to characterize the polarity and tumor suppressor genes hugl-1 and hugl-2 in functional analyses using siRNA-mediated gene silencing in epithelial cells and T lymphocytes. Furthermore, the functions and properties of mgl-2, the murine homologue of hugl-2, were analyzed in the Cre/loxP-mediated conditional knockout mouse model in vivo.rnrnIn this study, to characterize the biological effects of Hugl-1 and Hugl-2 on the growth behavior, migration and invasion of epithelial cells, various shRNA expression constructs were successfully generated and Hugl-suppressed cell lines established. In vitro studies as well as in vivo tumorigenicity analyses provided consistent evidence that reduced Hugl-1 and Hugl-2 expression levels play a significant role in mediating invasive and tumorigenic properties of epithelial cells. The loss of both homologues produced significantly stronger responses than the suppression of an individual homologue. Furthermore, the overexpression of the cell cycle regulator cyclin D1 and the hyperproliferation of Hugl-1 and/or Hugl-2-depleted epithelial cells suggested an important role of both homologues in cell cycle progression and cell proliferation. A low expression status of Hugl-1 and -2 also appeared to correlate with an increased development of resistance to chemotherapeutic agents. It could be shown in this study that T lymphocytes only express Hugl-1, which is necessary for the F-actin-mediated maintenance of T cell polarity and morphology. Hugl-1-suppressed T lymphocytes that had been stimulated via independent signaling pathways (TCR or chemokine receptor) showed a significant disruption of lamellipodia and uropod formation, suggesting an interaction of Hugl-1 at the level of F actin. Furthermore, it was found that the polarity regulator Hugl-1 positively influenced the CD3/TCR-induced cell adhesion. The analysis of T cell migration and motility revealed the importance of Hugl-1 for the polarization and migration of T cells in the chemokine gradient as well as on mDCs.rnrnTo elucidate the functional role of mgl-2 in vivo, a tamoxifen-inducible, Cre/loxP-mediated conditional mouse line was generated and analyzed. Mgl-2-deleted animals showed neither significant phenotypic differences nor differences in the organs’ anatomy. The loss therefore seemed to be compensated by co-expression of the possibly functionally redundant mgl-1 gene in the intestinal epithelium.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2064
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31649
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	186 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen