Authors:	Martin, Helen
Title:	Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung
Online publication date:	5-Jul-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Aus der zunehmenden Prävalenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erhöhter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausstämme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieansätze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung zunächst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc Mäusen etabliert. Diese Mausstämme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zusätzlichen Mutation des Gens für die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunität in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der Mäuse erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. Für die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. Während sich für den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten für die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker führte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entzündung in den Mäusen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich für das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mündete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Ausprägung einer Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabhängigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation auslöste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den Mäusen detektiert werden konnten, handelte es sich hauptsächlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, führten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentzündung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abhängig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung wurde das System zur Analyse des suppressionsfördernden Potentials des HIV-1 - Hüllproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 führte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies äußerte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der für die Humanisierung genutzten PBMCs abhängig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die Mäuse führte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen für die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Maßnahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen innovative Ansätze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt. Allergic diseases like asthma have an increasing prevalence and require the development of new therapeutic strategies. Animal models of allergic inflammation and airway hyperresponsiveness (AHR) have significantly improved our understanding of the underlying pathophysiological mechanisms of allergic airway disease. However, using murine systems as preclinical models for new biological treatment approaches like monoclonal antibodies is problematic, due to species-specific differences regarding the structure of the target molecules. Therefore, humanized mouse models have been developed to study human immune cell function in vivo and to test new therapeutic strategies not readily approachable through animal or human studies. Here we elucidated the immunodeficient mouse strains NOD-Scid and NOD-Scid gc to investigate allergic airway diseases. Initially we evaluated a model of allergic airway disease in immunodeficient NOD-Scid mice. Furthermore we used NOD-Scid gc mice that have in addition to the lack of T- and B-cells a deficiency in natural killer cells (NK-cells) based on a mutation of the IL-2 receptor gamma chain. This mutation improved the engraftment of the mice with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PBMCs were obtained from donors allergic to birch pollen or from healthy donors by Ficoll density centrifugation and were injected intraperitoneally into NOD-Scid mice or NOD-Scid gc respectively. On days 20-22 airways were provoked intranasally with allergen. On day 24 airway responsiveness and inflammation were analysed. Humanization of the NOD-Scid strain required transfer of 80 million PBMCs, whereas in NOD-Scid gc mice 5 million PBMCs were sufficient for engraftment. In both strains PBMCs from allergic donors but not from healthy donors induced airway inflammation and airway hyperresponsiveness. Particularly the additional application of allergen and human IL-4 leads to a strong pulmonary inflammation after transfer of PBMCs from allergic patients.The intranasal provocation with allergen on days 20-22 after reconstitution with human PBMCs was mandatory for the outcome of the allergic inflammation. Mice that were intranasally treated with phosphate buffered saline (PBS) failed to develop an airway inflammation. Animals did not develop AHR, had reduced numbers of cells in the bronchoalveolar lavage and diminished frequencies of human cells in the lung. The allergen-dependency of the established model was further confirmed by experiments showing that transfer of non-allergic PBMCs did not increase airway inflammation albeit human cells were injected together with allergen and IL-4. The human cells that were detectable after 24 days of engraftment were mainly T-cells. Within this CD3+ T-cell fraction CD4+ and CD8+ could be differentiated. Experiments in which T-cell subpopulations (CD3+, CD4+, CD8+) were depleted from PBMCs prior to transfer into the mice demonstrated that the occurring airway inflammation in the system was dependent on human CD4+ T-cells. After the establishment of the humanized mouse model of allergic airway disease we used the model to analyze the suppressive capacity of the HIV-1 envelope protein gp120. Previously it was demonstrated that stimulation of the CD4 molecule on human regulatory T- cells (Tregs) activates their suppressive activity. In this work we sought to determine the effect of CD4-mediated Treg-activation on pulmonary inflammation in a humanized mouse model of allergic airway inflammation. For Treg-activation, mice were treated with the CD4-binding, lck-activating recombinant HIV-1 surface protein gp120 after sensitization prior to allergen challenge. Control experiments with CD25-depleted PBMCs were performed to evaluate the role of Tregs. Treatment with gp120 prior to allergen challenge abrogated AHR and reduced the inflammatory immune response. In contrast, treatment had no effect on inflammation and AHR in mice that received CD25-depleted PBMCs, demonstrating Treg cell dependency of disease prevention. These results show that allergic airway inflammation can be prevented by stimulation of human Tregs by CD4. The findings further suggest a clinical potential of Treg-activation by high-affinity CD4. In summary, the present findings revealed that humanized mouse models can be effectively used to investigate human cell interactions and furthermore to evaluate effects of novel therapeutic approaches on human cells under in vivo conditions.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2063
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31639
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	146 S.
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