Authors:	Blättel, Verena
Title:	Identifizierung, Quantifizierung und Hemmung von ausgewählten Hefen im Wein
Online publication date:	15-Jun-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Hefen stellen einen großen und wichtigen Teil der Mikrobiota während der Weinbereitung dar, da ohne ihre alkoholische Fermentation die Umwandlung von Most und Wein nicht möglich wäre. Ferner ist es ihre Vielzahl an Stoffwechselprodukten, die dem Aroma des fertigen Weines eine zusätzliche Komplexität verleihen. Auf der anderen Seite steht durch den Metabolismus verschiedenster so genannter Wildhefen die Gefahr von Qualitätsabstufungen der Weine, was allgemein als „Weinfehler“ betrachtet wird. Ziel dieser Arbeit war zum einen die taxonomische Einordnung von Saccharomyces-Spezies, sowie die Quantifizierung und Hemmung von ausgewählten Wildhefen während der Weinbereitung.rnEin Teil dieser Arbeit umfasste die Identifizierung der nahverwandten Mitglieder der Saccharomyces sensu stricto-Gruppe. Durch den Einsatz des DNA-Fingerpinting-Systems SAPD-PCR konnten alle die Gruppe umfassenden Spezies anhand spezifischer Bandenmuster nachgewiesen werden, wodurch eine Einordnung dieser schwer zu differenzierenden Arten möglich war. Die Differenzierung zwischen den einzelnen Spezies war in jedem Fall deutlicher als dies die Sequenzierung der 5.8S rDNA und ihre flankierenden ITS-Regionen vermochte. Die SAPD-PCR zeichnete sich zudem durch eine geringe Muster-Varianz bei verschiedenen Stämmen einer Art aus und konnte zuverlässig unbekannte Stämme bestimmen und bereits hinterlegte Stämme neu klassifizieren. Zudem konnte mit Hilfe dieses Systems Hybride aus Saccharomyces cerevisiae und S. bayanus bzw. S. cerevisiae und S. kudriavzevii detektiert werden, wenn diese Hybride aus relativ gleichen genomischen Anteilen der Eltern bestanden. rnZusätzlich wurde ein quantitatives PCR-System entwickelt, um die Gattungen Saccharomyces, Hanseniaspora und Brettanomyces in Most und Wein detektieren und quantifizieren zu können. Die hierfür entwickelten Primer zeigten sich spezifisch für die untersuchten Arten. Durch die serielle Verdünnung definierter DNA-Mengen konnte für alle drei Systeme eine Kalibrierungskurve erstellt werden, mit Hilfe derer die tatsächlichen Quantifizierungen durchgeführt wurden. Die qPCR-Analyse lieferte ähnliche Zellzahlen wie Lebendzellzahl-Bestimmungen und wurde nicht von anderen Spezies und von Traubensaft gestört. Die maximal detektierbare Zellzahl betrug 2 x 107 Zellen/ml, während die minimale Detektionsgrenze je nach Art zwischen 1 x 102 Zellen/ml und 1 x 103 Zellen/ml lag. Allerdings konnte eine effektive DNA-Isolierung dieser geringen Zellzahlen nur erreicht werden, wenn die Zellzahl durch artfremde Hefen künstlich erhöht wurde. Die Analyse einer Most-Vergärung mit den drei Spezies zeigte schlussendlich, dass die quantitative PCR sicher und schnell Veränderungen und Sukzessionen detektiert und so ein geeignetes Mittel darstellt, um Populationsdynamiken während der Weinherstellung zu beobachten. rnDer letzte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Inhibierung von Schadhefen durch zellwand-hydrolysierende Enzyme. Es konnte hierbei eine endoglykosidisch wirkende β-1,3-Glucanase aus dem Bakterium Delftia tsuruhatensis isoliert werden. Diese besaß eine ungefähre Masse von 28 kDa, einen isolektrischen Punkt von ca. 4,3 und wirkte mit einer spezifischen Aktivität von 10 U/mg Protein gegen das Glucan Laminarin. Zudem zeigte das Enzym ein Temperaturoptimum von 50 °C und ein pH-Optimum bei pH 4,0. Weinparameter wie erhöhte Konzentrationen an Ethanol, Phenolen und Sulfit beeinflussten die Wirkung des Enzyms nicht oder nur wenig. Neben der allgemeinen Wirkung gegen β-1,3-Glucane konnte hier auch gezeigt werden, dass ebenso gut die β-1,3-Glucane in der Zellwand verschiedener Hefen hydrolysiert wurden. Fluoreszenz- und rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen von Hefezellen nach Inkubation mit der β-1,3-Glucanase zeigten zusätzlich die Zerstörung der Zelloberfläche der Hefen. Die lytische Wirkung des Enzyms wurde an verschiedenen weintypischen Hefen getestet. Hierbei zeigten sich stammspezifische Unterschiede in der Sensitivität gegenüber dem Enzym. Außerdem konnte festgestellt werden, dass sowohl Wachstumsphase als auch Medium der Hefen Einfluss auf deren Zellwand hat und somit auch auf die Wirkung des Enzyms.rn Yeasts present an important part of the microbiota during winemaking due to their ability to convert sugar into ethanol, must into wine. Moreover there is a variety of their metabolic products that can improve the wine flavour. On the other hand, other products of different wild-type yeasts can lead to a decline of wine quality. Therefore the aim of this study was the taxonomic classification and identification of Saccharomyces species, as well as the real-time quantitative determination and the growth inhibition of selected wild-type yeasts during winemaking.rnOne part of this work contained the identification of the close related members of the Saccharomyces sensu stricto group. The DNA fingerprinting method SAPD-PCR was able to differentiate all eight species within this group. This classification was much clearer than comparison of 5.8 ribosomal DNA and its neighbouring ITS regions of these species. SAPD-PCR generated no great variance of the DNA patterns within strains of one species and it was possible to identify unknown strains and reclassify strains already deposited. In addition hybrid strains like Saccharomyces cerevisiae x bayanus and S. cerevisiae x kudriavzevii could be detected by SAPD-PCR fingerprinting, if these hybrids consisted of nearly equal genomic amounts of the parental species. rnFurthermore a real-time PCR method was developed for detection and quantification of the genera Saccharomyces, Hanseniaspora and Brettanomyces. The designed primers were specific for the selected species. Running the systems with serial DNA dilutions, calibration lines were generated which provide the basis for total quantification of cell numbers. Comparing to colony forming units, the amount of cells detected by the real-time PCR was similar. The maximum of cells that were able to determine by PCR was 2 x 107 cells/ml, whereas the minimal detection limit was between 1 x 102 cells/ml and 1 x 103 cells/ml. rnThe last part of this study dealt with the inhibition of undesirable yeasts by means of cell wall hydrolyzing enzymes. It was able to isolate and characterize an endo-β-1,3-glucanase from the bacterium Delftia tsuruhatensis. This enzyme had an molecular mass of approx. 28 kDa, an isoelectric point of 4,3 and a specific activity of 10 U/mg. Its optimal temperature was 50 °C and the pH optimum was pH 4,0. Typical parameters in wine like ethanol, phenols and suphite had no great negative influence on the activity of the enzyme. Besides its general effect on β-1,3-glucanes it could be shown that this enzyme attacked the β-1,3-glucan of the yeast cell wall. Different microscopic examinations revealed a damage of the cell surface as a result of incubation yeast cells with the enzyme. The lytic action of the enyzme was tested with regard to different yeast species that are common in must and wine. These tests exhibited a diverse sensitivity on strain level. In addition it could be noted that growth conditions such as media and growth stage of yeasts can influence the cell wall and therefore the efficiency of the hydrolytic enzyme. rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2049
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31489
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	194 S.
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