Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2041
Authors: Höhn, Yvette
Title: Generierung und Charakterisierung tolerogener muriner dendritischer Zellen
Online publication date: 5-Jun-2012
Language: german
Abstract: Mechanismen der zentralen und der peripheren Toleranz schützen den Körper vor Immunreaktionen gegen körpereigenes Gewebe oder gegen harmlose Umweltantigene. An der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sind tolerogene Dendritische Zellen (DC) beteiligt. Tolerogene DC können in vitro u.a. mit Hilfe von immunsuppressiven und antiinflammatorischen Substanzen, aber auch durch virale Transduktionen, die zur Denovo- oder Überexpression toleranzassoziierter Moleküle führen, generiert werden. rnDa die Wirkung einiger immunmodulatorischer Substanzen über den intrazellulären sekundären Botenstoff cAMP vermittelt wird, sollte getestet werden, welchen Einfluss eine direkte Erhöhung des intrazellulären cAMP-Niveaus mittels Dibutyryl-cyclo-Adenosin-3´,5´-Mono-Phoshat (db-cAMP) auf die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von BM-DC („bone marrow derived dendritic cells“) hat.rnIm Vergleich zu unbehandelten BM-DC wiesen db-cAMP-DC ein vermindertes T-Zell-Stimulierungs-potenzial auf. Dieses verminderte T-Zell-Stimulierungspotenzial wird teilweise über die Proteinkinase A, nicht aber über Cyclooxygenase-2 (Cox-2) vermittelt. rnAnhand der FACS-Analyse mit DC- und MDSC- („myeloid derived suppressor cells“) spezifischen Markern konnte gezeigt werden, dass es sich bei den db-cAMP-DC um CD11c-positive DC mit einer vergleichsweise niedrigen Expression von MHCII und kostimulatorischen Oberflächenmolekülen handelt. Des Weiteren zeigte sich, dass sie verglichen mit BM-DC eine vermehrte mRNA-Expression der koinhibitorischen Moleküle B7-H1 und LIGHT und der toleranzassoziierten Moleküle FcγRIIB, HO-1 und Cox-2 aufweisen. Mittels ELISA konnte eine gesteigerte Expression der HO-1- und eine moderat gesteigerte PGE2-Synthese beobachtet werden. PGE2 wird mit Hilfe der Cox-2 aus Arachidonsäure gebildet.rnIm Gegensatz zu BM-DC wiesen db-cAMP-DC in beiden Reifungsstadien ein verändertes Zytokinprofil auf: Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass db-cAMP-DC verglichen mit BM-DC vermehrt IL-1RA und IL-10 exprimieren. Dieser Unterschied konnte für IL-10 auch mittels ELISA bestätigt werden. In den Kulturüberständen der stimulierten db-cAMP-DC konnte, im Gegensatz zu denen stimulierter BM-DC, kaum bioaktives IL-12 nachgewiesen werden. rnDb-cAMP-DC induzierten des Weiteren in kokultivierten allogenen T-Zellen ein differenzielles Zytokinprofil: Sie förderten die INFγ- und IL-17-Sezernierung durch T-Zellen, während die IL-5-Sezernierung geringer war, wenn T-Zellen mit stimulierten db-cAMP-DC kokultiviert wurden. Db-cAMP-DC hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion. Außerdem führte eine Kokultur der db-cAMP-DC mit allogenen T-Zellen nicht zu einer gesteigerten Induktion von FoxP3+ Treg. rnIn einem zweiten Ansatz sollte getestet werden ob es möglich ist die murine DC-Linie SP37A3 lentiviral mit dem toleranzassoziierten Oberflächenprotein B7-H3 zu transduzieren. Dies ist von Interesse, da die SP37A3-Zellen einige Vorteile gegenüber BM-DC aufweisen, wie z.B. ihren homogeneren Phänotyp und die Möglichkeit sie in einer Expansionskultur zu halten.rnEs konnte gezeigt werden, dass SP37A3-Zellen als Modell für myeloide DC für die Transduktion mit lentiviralen Partikeln geeignet sind. Hierbei zeigte es sich aber, dass darauf geachtet werden muss, mit konzentriertem Virus zu arbeiten und dass die Reportergen-Expression der Zielzellen über mehr als 3 Tage (mindestens 7 Tage) untersucht werden muss. Nur so kann eine eventuell auftretende Pseudotransduktion erkannt und verhindert werden. Ab einer MOI („multiplicity of infection“) von 50 konnte in SP37A3-Zellen eine Transgen-Expression nachgewiesen werden.rn
The mechanisms of central and peripheral tolerance protect the body from unwanted immune reactions against self and harmless antigens. Tolerogenic dendritic cells (DC) contribute to the maintenance of the peripheral tolerance. DC can be tolerized in vitro by applying immunomodulatory substances or via lentiviral transduction that leads to the de novo or overexpression of tolerance associated molecules.rnThe tolerizing effect of several immunmodulatory compounds was shown to involve the activation of the intracellular second messenger cAMP. Therefore, the effect of a direct increase in the intracellular cAMP-level of murine BM-DC by dibutyryl-cAMP (db-cAMP) on the phenotypical and functional properties was elucidated.rnCompared to BM-DC, db-cAMP-DC exerted a diminished T-cell-stimulatory capacity. This was partially mediated by Protein kinase A, but not by Cyclooxygenase 2 (Cox-2). rnWhen DC- and myeloid derived suppressor cell markers where analyzed by FACS-analysis, db-cAMP-DC were characterized as CD11c-positive dendritic cells with low surface expression of costimulatory molecules and MHCII. Furthermore they had an increased mRNA-level of the coinhibitory molecules B7-H1 and LIGHT and of the tolerance associated molecules FcγRIIB, HO-1 and Cox-2. Accordingly, on the protein level an increased amount of HO-1 and PGE2 was detected. Cox-2 mediates the synthesis of PGE2 from arachidonic acid.rnCompared with BM-DC, db-AMP-DC displayed an altered cytokine pattern: They expressed more IL-1RA and IL-10 on the mRNA level. This upregulation could also be validated for IL-10 by ELISA. In contrast to stimulated BM-DC, the culture supernatants of db-cAMP-DC hardly contained bioactive IL-12. rnDb-cAMP-DC induced a different cytokine pattern in cocultivated T-cells as compared with BM-DC: They increased the INFγ- and IL-17-secretion by interacting T-cells, while the secretion of IL-5 was lower when employing stimulated db-cAMP-DC. Db-cAMP-DC had no effect on IL-10 production or on the induction of FoxP3+ regulatory T-cells. rnrnIn a second approach, it should be tested whether it is possible to overexpress the tolerance associated surface protein B7-H3 in the murine DC line SP37A3 by lentiviral transduction. SP37A3 cells display an attractive alternative to BM-DC because they constitute a more homogenous population and they can be cultured over a long time period without losing their properties.rnIt could be shown that SP37A3 cells represent a proper myeloid DC model for the transduction with lentiviruses. In this respect it has to be emphasized that it is important to use concentrated virus particles and to analyze the expression of the reporter gene for more than 3 days (at least 7 days), in order to exclude pseudotransduction. SP37A3 cells were efficiently transduced starting at MOI (multiplicity of infection) 50.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2041
URN: urn:nbn:de:hebis:77-31409
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 183 S.
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