Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2037
Authors: Schmid, Beate
Title: Generierung eines BAC-transgenen Mausstamms zur Analyse von Melanomen
Online publication date: 25-May-2012
Language: german
Abstract: Da Tumorerkrankungen ein enormes Gesundheitsproblem in der westlichen Welt darstellen, wird eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien entwickelt. Neuartige Tumor-Therapeutika werden jedoch üblicherweise zunächst an Tiermodellen evaluiert, bevor sie am Menschen angewandt werden.\r\nIn der vorliegenden Arbeit wurde ein BAC-transgenes Mausmodell generiert, welches als autochthones Melanommodell zur Anwendung kommen sollte.\r\nZunächst wurde dafür ein DNA-Konstrukt erzeugt. Dieses enthält die Melanom-Onkogene BrafV600E, Cdk4R24C und Mitf deren Expression durch die Tamoxifen-induzierbare Rekombinase CreERT2 kontrollierbar sein sollte. Die Verwendung des Tyrosinasepromoters sollte die melanozytenspezifische Expression der eingebrachten Gene gewährleisten. Ein weiterer Bestandteil des Konstrukts ist ein Luziferase-Gen, welches die Lokalisierung Onkogen-exprimierender Zellen durch in vivo-Biolumineszenz-Imaging erlaubt, da die Onkogen- und Luziferase-Expression durch 2A-Sequenzen gekoppelt sind.\r\nVor der Generierung der transgenen Tiere sollten in vitro Analysen die Funktionalität des Konstruktteils, bestehend aus den Onkogenen und der Luziferase, klären. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie C22 mit einem Expressionsvektor transfiziert, welcher den genannten Konstruktteil enthielt. Es konnte ein Anstieg der Braf- und Cdk4-Expression auf Protein Ebene, das Vorhandensein von Luziferase-Aktivität und die Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Funktionalität des untersuchten Konstruktteils war damit nahegelegt und die Generierung der transgenen Tiere wurde fortgesetzt.\r\nDie Pronukeus-Injektion resultierte schließlich in 3 Founder-Tieren, die mittels PCR und Southern Blot identifiziert wurden und die Bezeichnung „B6 tg Tyr iOnkogene“ (TyriOn) erhielten. Durch Verkreuzen der Founder-Tiere mit C57BL/6 Mäusen wurden im weiteren Verlauf 3 Linien erzeugt. Bei in vivo Biolumineszenz-Messungen zeigten Tiere der Linie D einen gewissen Grad an Hintergrund-Luziferase-Aktivität, die jedoch durch Tamoxifen-Injektionen verstärkt werden konnte. In den Folgegenerationen ging diese Tamoxifen-induzierte Verstärkung der Luziferase- Aktivität teilweise verloren. Es wurde die Vermutung angestellt, dass funktionelle und nicht-funktionelle Varianten des Transgens an unterschiedlichen Stellen im Genom von Founder D integriert hatten, und sich in den folgenden Generationen auf die Nachkommen verteilten. Die mangelnde Induzierbarkeit betroffener Tiere konnte nicht auf fehlende Integrität der Sequenz „iOnkogene“ in diesen Tieren oder auf nicht-funktionelle loxP-Stellen im Konstrukt zurückgeführt werden.\r\nTamoxifen-Injektionen führten in TyriOn-D Tieren im Laufe von 15 Monaten nicht zur Entwicklung von Tumoren. Ebenso wenig konnten in TyriOn-D / Cre del Tieren, welche die eingebrachten Onkogene maximal exprimieren sollten, Tumoren detektiert werden. Um zu analysieren, ob die eingebrachten Onkogene die Bildung von Tumoren begünstigen, wurden TyriOn-D Tiere mit dem Melanom-anfälligen Stamm MT/ret verkreuzt. Hierzu konnte im Rahmen dieser Arbeit noch kein Ergebnis erzielt werden. Allerdings konnte in Melanomen von TyriOn-D / MT/ret Tieren Luziferase-Aktivität bei in vivo Biolumineszenz-Messungen und CreERT2 RNA durch RT-PCR detektiert werden.\r\nTyriOn-D / MT/ret Tiere werden im weiteren Verlauf dieses Projektes nicht nur der Analyse der Melanomentwicklung dienen. Deren Tumore ermöglichen außerdem weitere Untersuchungen bezüglich der Funktionalität des Konstrukts, die teilweise in TyriOn Tieren keine Resultate ergaben.
Since tumors represent a major health problem in the Western world, various new treatment strategies are in development. These novel cancer therapeutics, though, need to be evaluated in animal models before application in humans. This work is about the generation and analysis of a BAC transgenic mouse model that is to be applied as an autochthonous melanoma model. The construct generated allows the inducible expression of the melanoma oncogenes BrafV600E, Cdk4R24C and Mitf under the control of the melanocyte specific tyrosinase promoter. Furthermore the gene for firefly luciferase was introduced, which enables monitoring of oncogene expression by bioluminescent imaging. Transcription of these genes is controlled by the tamoxifen inducible recombinase CreERT2 also expressed specifically in melanocytes. In vitro studies of C22 cells transfected with the vector pcDNA3.1 containing the oncogene-luciferase expression construct indeed showed an increase in Braf and Cdk4 expression by western blot, luciferase activity as well as the activation of the MAPK pathway indicating the functionality of the construct. The pronucleus injection of the final BAC construct resulted in three founders confirmed by PCR and southern blot. Analysis of the 3 generated lines „B6 tg Tyr iOnkogene-A, -C and -D “ (TyriOn-A, -C and -D) by in vivo bioluminescent imaging showed some base line luciferase activity in line D indicating leakiness of the transgenic construct. However, tamoxifen treatment greatly enhanced the luciferase activity indicating that the construct is operating as intended. In the following generations of line D tamoxifen induced enhancement of luciferase activity was partially lost. Presumably functional and non-functional variants of the construct integrated at different sites of the genome of founder D and were distributed to the descendants. The absence of inducibility could neither be attributed to a lack of integrity of the sequence „iOnkogene“ nor to non-functional loxP sites of the construct. Tumors could not be detected in tamoxifen treated TyriOn-D mice in the course of around 15 months. TyriOn-D / Cre deleter mice which express only the recombined variant of the construct neither developed tumors during this period. To analyze whether the introduced oncogenes favor the formation of tumors TyriOn-D mice were crossed to the melanoma-susceptible strain MT/ret. These experiments are still ongoing. However, melanomas of TyriOn-D / MT/ret mice show luciferase activity in in vivo bioluminescent imaging and contain CreERT2 RNA detected by RT-PCR. In the course of this project TyriOn-D / MT/ret mice will not only be used to analyze the development of melanoma. Their tumors also allow further investigation regarding the functionality of the construct.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2037
URN: urn:nbn:de:hebis:77-31368
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 91 S.
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