Authors:	Brüstle, Ivonne
Title:	Einfluss unterschiedlicher polymerer Nanopartikel auf das Differenzierungsverhalten von humanen Stammzellen
Online publication date:	9-May-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	n der vorliegenden Dissertation wurde systematisch die Interaktion von rnunterschiedlichen polymeren Nanopartikeln auf die Zellfunktionalität und das rnDifferenzierungspotential zweier humaner Stammzelllinien (mesenchymale und rnhämatopoetische Stammzellen) untersucht. Als Modellsystem wurden Polystyrol-rnPartikel für bioinerte Nanopartikel und PLLA-Partikel als Modell für bioabbaubare Nanopartikel gewählt. rnDie Analyse der Partikelaufnahme und der Zytotoxizität ergab, dass alle getesteten Partikel nach einen Zeitraum von 24 h und einer Inkubation mit 300 µg/mL Partikeln in beiden Zellsorten nicht toxisch waren. Für die CTMA-Cl-stabilisierten Partikel wurde während Differenzierungsversuche mit hMSCs eine Langzeittoxizität festgestellt, so dass diese Partikel für weitere Versuche nicht verwendet werden konnten. rnAlle Partikel wurden in die Zellen aufgenommen. Die Lutensol-stabilisierten Polystyrol-Partikel zeigten sowohl in unfunktionalisierter Form als auch mit Aminogruppen auf der Oberfläche ein geringeres Aufnahmeverhalten in hMSCs und wurden deswegen nicht für weitere Versuche verwendet. Die SDS-stabilisierten Polystyrol- Partikel zeigten eine gute Aufnahme, die durch die funktionalisierung mit Carboxylgruppen um ca. das 3-fache rnverstärkt werden konnte (hMSCs). Gleiches wurde für die CTMA-Cl stabilisierten rnPolystyrol und dem dazugehörigen aminofunktionalisierten Partikel beobachtet rn(hMSCs). In hHSCs wurden nur die SDS-stabilisierten Polystyrol-Partikel (nicht rnfunktionalisiert, carboxylfunktionalisiert) getestet. Hierbei konnte kein Unterschied bezüglich der Aufnahme festgestellt werden. Die PLLA- und PLLA-Fe-Partikel wurden sowohl in hMSCs als auch in hHSCs sehr gut und besser als die Polystyrol-Partikel aufgenommen. Das in den Partikeln eingebaute Magnetit zeigt keine Auswirkungen auf die Zellaufnahme. Für weitere Versuche wurden deshalb auf Grund der Aufnahme und Toxizitätsdaten die SDS-stabilisierten Polystyrol-Partikel (PS und PS-COOH) sowie die ebenfalls SDS-stabilisierten PLLA-Partikel (PLLA und PLLA-Fe) gewählt. Somit standen 4 Partikel zur Auswahl, die sich sowohl in ihrer Größe als auch im verwendeten Tensid nicht unterscheiden und so Aussagen über den Einfluss von Oberflächenfunktionalisierung sowie Magnetit zulassen. rnDie Zellfunktionalität der hMSCs unter Partikeleinfluss wurde mit Hilfe von IL-6 und IL-8 Messungen untersucht, hierbei zeigte sich, dass nur der PLLA-Fe-Partikel zu einer signifikant erhöhten IL-8 Ausschüttung führte, die Sekretion von IL-6 blieb vollständig unverändert. Die IL-8 Sekretion der hHSCs wurde durch die Anwesenheit der Partikel nicht verändert. rnUm den Einfluss der oben beschriebenen Partikel auf das Differenzierungspotential von hMSCs und hHSCs zu untersuchen, wurden beide Zelllinien vor der Induktion der Differenzierung für 24 h mit 300 µg/mL Partikeln inkubiert. Sowohl die histochemischen Färbungen der differenzierten hMSCs als auch die CD-Marker-Färbungen der differenzierten hHSCs zeigten keinen Einfluss der Partikel auf die Differenzierungsfähigkeit. Bei den hMSCs konnte auch keine durch die Partikel hervorgerufene Differenzierung nachgewiesen werden. Die Analyse der Differenzierung auf RNA-Ebene (qPCR) ergab jedoch für beide Zelllinien, dass einzelne Partikel einzelne Differenzierungsmarker in ihrer Expression positiv oder negativ beeinflussen. Einzig der PLLA-Partikel zeigt bei allen untersuchten Differenzierungsrichtungen in beiden Zelllinien rnkeine Veränderung der Expression. Die jeweils beobachteten Expressionsveränderungen sind jedoch nicht stark genug, um die Differenzierung sichtbar zu beeinflussen, was die histologischen bzw. CD-Marker-Färbungen gezeigt haben. rnIn einem Kooperationsprojekt mit der Gruppe von Arancha del Campo (MPI für rnPolymerforschung) wurde der Einfluss unterschiedlicher BMP-2-Peptide auf die rnosteogene Differenzierung von hMSCs untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Peptide in keiner Konzentration und Kombination eine positive Wirkung auf die osteogene Differenzierung haben. rnIm Rahmen eines Kooperationsprojekts mit Kerstin Münnemann (MPI für rnPolymerforschung) konnte gezeigt werden, dass eine quantitative Bestimmung des rnzellulären Eisengehalts nach Inkubation mit SPIOs sowohl mit Hilfe von MRT, H1rn NMR als auch UV/VIS Messungen bis zu einem Detektionslimit von 100.000 Zellen /mL (bei einer Beladung von 10 pg Fe/Zelle) erfolgen kann. This thesis investigates with the influence of different polymeric nanoparticles on the cell functionality and differentiation capacity of human mesenchymal and hematopoietic stem cells. As a model system two bioinert polystyrene and two biodegradable PLLA particles were chosen. rnFlow cytometry analysis showed that all particles are non-toxic after an incubation time of 24 h with a particle amount of 300 µg/mL either for hMSCs or hHSCs. In the case of the CTMA-Cl stabilized polystyrene particles a long term toxicity during hMSC differentiation was detected. These particles were not used for further experiments. rnAll particles showed cellular uptake, but the uptake of the Lutensol stabilized rnpolystyrene particles (non-functionalized, amino-functionalizied) in hMSCs was low. So these particles were not used for other experiments. For hMSCs the SDS stabilized polystyrene particles showed a good uptake rate in hMSCs, which was 3 fold increased in the case of the carboxy-functionalized particles. The CTMA-Cl stabilized polystyrene particles (non-functionalized, amino-functionalized) displayed the same uptake behavior In hMSCs. In hHSCs only the SDS stabilized polystyrene particles were tested, here the rnfunctionalization with carboxy groups did not lead to an increased cell uptake. The cellular uptake of the PLLA and PLLA-Fe particles in hMSCs and hHSCs achieved good results that were better than those of the polystyrene particles. The incorporated magnetite did not influence the cellular uptake. rnTwo sets of tested particles were chosen for further experiments: the SDS stabilized polystyrene particles (PS and PS-COOH) and the also SDS stabilized PLLA and PLLA-Fe particles. These 4 particles were similar in size and stabilized with the same surfactant therefore allowing conclusions about the influence of surface functionality and magnetite on stem cells. rnCell functionality was analyzed with quantitative IL-6 and IL-8 measurements. For hMSCS only the PLLA-Fe particle leads to a significant higher IL-8 secretion, IL-6 secretions was not affected. The IL-8 secretion of hHSCs was not altered in the presence of all tested particles. rnTo test whether the above described particles show an influence on the differentiation potential of hMSCs and hHSCs, both cell lines were incubated for 24 h with 300 µg/mL particles before inducing differentiation. Cytochemical staining (hMSCs) and CD marker staining did not show chances in the differentiation due to particle presence. Particles did also show no potential to induce differentiation in hMSCs. Analysis of the differentiation on the RNA level with qPCR displayed for both cell lines, that some particles had a positive or negative influence on the expression of particular differentiation markers. The only particle which did not alter the expression profile in rnboth cell lines was the PLLA particle. The observed chances in the differentiation marker expression were however not severe enough to cause a visible effect in the differentiation process; this was shown by positive cytochemical staining (hMSCs) and CD marker stainings (hHSCc). rnThe influence of different BMP-2 peptides on the osteogenic differentiation of hMSCs was analyzed in a cooperation project with the group of Arancha del Campo (MPI for Polymer Research). The results showed that there was no positive effects of the different peptides on the osteogenic differentiation. This was the case for all the tested concentrations and peptide combinations. rnIn cooperation with Kerstin Münnemann (MPI for Polymer Research) it could be shown, that quantitative analysis of the iron content of with SPIOs incubated cells is possible down to 100 .000 cells/mL (with an iron payload of 10 pg/cell). This was the case for MRI, H1 NMR and UV/VIS measurements. rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	MaxPlanck GraduateCenter
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2023
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-31138
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	139 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen