Authors:	Nayak, Tanmoyita
Title:	Characterization of the functional and signaling properties of the Intracellular domain of the NG2 proteoglycan
Online publication date:	8-Jul-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	The NG2 proteoglycan is a molecular marker of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) and is abundantly expressed by a variety of tumours. Published results show that NG2 influences proliferation, migration, and has neuromodulatory effects. Like other type-1 transmembrane proteins, NG2 is subjected to regulated intramembrane proteolysis (RIP), generating a large ectodomain, a C-terminal fragment (CTF) and an intracellular domain (ICD) by the sequential action of α- and γ-secretases. The cleavage of NG2 is constitutive and enhanced by neuronal activity. Functional roles of the NG2 protein domains have so far been shown for the full-length protein, the released ectodomain and CTF, but not for the ICD. This study characterized the role of the NG2 ICD in a murine OPC cell line (Oli-neu), primary OPCs and human embryonic kidney (HEK) cells. It was found that the cleaved NG2 ICD has a predominantly cytosolic expression including the distal processes of OPCs. A small fraction of the protein exhibits a nuclear localization. Immunoprecipitation coupled with Mass Spectrometric analysis indicated that the NG2 ICD modulates mRNA translation and cell-cycle kinetics. Functional studies showed that ICD overexpression results in an upregulated translation of mRNAs as well as a shift of the cell population towards S-phase. NG2 ICD increases levels of the active (phosphorylated) form of mTOR and modulates downstream signaling cascades. These include increased phosphorylation of p70S6K1 and increased expression of eEF2. Strikingly, levels of FMRP, a translation repressor and RNA-binding protein that is regulated by mTOR/S6K1/eEF2 were decreased upon ICD overexpression. De novo proteomic profiling by pulsed-SILAC method after NG2 ICD overexpression revealed that proteins regulating DNA replication, cell differentiation and apoptosis were highly enriched in the NG2 ICD-overexpressing population. This study establishes that the NG2 ICD, after release by cleavage, acts as a regulator of translation and cell cycle progression in OPCs by modulating the mTOR pathway, a known global translational regulator. It also influences levels of FMRP, a protein responding to network activity and a well-characterized repressor of translation. Findings from this study additionally help to explain why tumours exhibiting enhanced rates of translation and rapid cell cycle kinetics express high levels of NG2. Das Proteoglycan NG2 ist ein molekularer Marker für oligodendrogliale Vorläuferzellen (OPCs) und zeigt eine starke Expressionsrate in verschiedensten Tumoren. Die Literatur besagt, dass NG2 Proliferation, Migration und Neuromodulation beeinflusst. Wie andere Typ-1 Transmembran Proteine unterläuft NG2 eine von α- und γ-Sekretasen gesteuerte sequentielle Intramembran-Proteolyse (RIP), wobei eine große Ektodomäne, ein C-terminales Fragment (CTF) und eine intrazelluläre Domäne (ICD) entstehen. Die Spaltung NG2s ist konstitutiv, wird aber durch neuronale Aktivität verstärkt. Bis jetzt konnten funktionelle Rollen des gesamten NG2-Proteins, der abgespaltenen Ektodomäne und des CTFs dargestellt werden, jedoch nicht von der ICD. Diese Studie charakterisiert die Rolle der NG2-ICD in einer murinen OPC Zelllinie (Oli-neu), in primären OPCs und menschlichen embryonale Nierenzellen (Hek). Es wurde festgestellt, dass die abgespaltene NG2-ICD vorherrschend cytosolisch, bis in die distalen Fortsätze der OPCs, exprimiert wird. Ein kleiner Anteil des Proteins weist eine nukleäre Lokalisation auf. Immunpräzipitationen, sowie massenspektrometrische Analysen, wiesen darauf hin, dass die NG2-ICD mRNA Translation und die Kinetik des Zellzyklus moduliert. Funktionelle Studien zeigten, dass eine ICD Überexpression zur verstärkten Translation von mRNAs und zu einer Zellzyklusverschiebung, hin zur S-Phase, führten. Die NG2-ICD erhöht das Level an aktivem (phosphoryliertem) mTOR und moduliert die fortlaufenden Signalkaskaden. Diese beinhalten die Phosphorylierung von p70S6K1 und die vermehrte Expression von eEF2. Bemerkenswerterweise ist das Niveau von FMRP, einem Translations-Repressor und RNA-Bindeprotein welches durch mTOR/S6K1/eEF2 reguliert wird, nach ICD Überexpression vermindert. pSILAC basierte Proteom Analysen, infolge von NG2-ICD Überexpression, resultierten in einer Anreicherung von DNA-, Zelldifferenzierung- und Apoptose regulierenden Proteinen. Diese Studie zeigt erstmalig, dass die gespaltene und freigegebene NG2-ICD, über die Modulierung des globalen translationsregulierenden mTOR-Pathways und des aktivitäts-abhängigen Proteins FMRP, Translation und Zellzyklusprogression in OPCs reguliert. Die hiermit aufgedeckte OPC-Signalkaskade kann durch das neuronale Netzwerk beeinflusst werden, da die Spaltung der NG2-ICD sowohl konstitutiv als auch aktivitätsabhängig erfolgt. Darüber hinaus erklären die Ergebnisse dieser Studie die erhöhten Translationsraten und die schnelle Zellzykluskinetik von stark NG2-positiven Tumoren.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2008
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000028595
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	125 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen