Charakterisierung des DxxxQ-Phosphatasemotivs des Sauerstoffsensors NreB in Staphylococcus carnosus
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In Bakterien regulieren Zweikomponentensysteme die Stoffwechselwege abhängig von den die Bakterien umgebenden Stimuli. Die Signaltransduktion erfolgt mittels Phosphoryltransfer von der den Reiz detektierenden Sensorhistidinkinase auf den Antwortregulator, welcher die spezifische Zellantwort auslöst. Dabei ist die Aktivierung des Antwortregulators durch Phosphorylierung und auch dessen Inaktivierung durch Dephosphorylierung von entscheidender Bedeutung. Das Gleichgewicht von Phosphorylierung und Dephosphorylierung gewährleistet die korrekte Adaptation des Stoffwechsels an die Stimuli. In HisKA_3 Sensorhistidinkinasen wurde ein DxxxQ-Phosphatasemotiv identifiziert, dessen konservierte Aminosäuren in der Regulation der Kinase- und Phosphataseaktivität der Sensoren eine entscheidende Rolle spielen.
Das fakultativ anaerobe Bakterium Staphylococcus carnosus reguliert die anaerobe Nitratatmung über das NreBC-Zweikomponentensystem und den Nitratsensor NreA. Der Sauerstoffsensor NreB enthält ebenfalls ein DxxxQ-Motiv, dessen Funktion für NreB in der Regulation der anaeroben Nitratatmung in vivo und in vitro untersucht wurde. Die Funktion des konservierten Aspartatrests NreB(D160) konnte aufgrund von sich widersprechenden in vivo und in vitro Ergebnissen nicht eindeutig bestätigt werden. Varianten zeigten in in vivo Reportergenstudien eine durch Nitrat stimulierbare wildtypische Aktivität, während sie in vitro keine Autophosphorylierungsaktivität hatten. Der konservierte Glutaminrest NreB(Q164) spielt dagegen eine Rolle in der Dephosphorylierung des Antwortregulators. In Varianten ist die Dephosphorylierung von NreC sowohl in vivo wie in vitro gehemmt. Zusätzlich zur Phosphataseaktivität des Sensors NreB wird die Dephosphorylierung des Antwortregulators teilweise auch durch eine intrinsische Phosphataseaktivität von NreC katalysiert. Der Nitratsensor NreA hat keinen Einfluss auf die Dephosphorylierung von NreC.
Der Phosphoryltransfer im NreBC-Zweikomponentensystem erfolgt von NreB(H159) auf NreC(D53). In vivo Reportergenstudien weisen auf eine zusätzliche, NreB(H159) unabhängige Aktivierung des Systems hin, während durch in vitro Phosphorylierungen des Antwortregulators NreC mit dem niedermolekularen Phosphodonor Carbamoylphosphat der konservierte Aspartatrest NreC(D53) als einziges Phosphorylierungsziel identifiziert wurde. Als Alternative zu Phosphorylierungsstudien mittels radioaktiv markiertem [γ-33P]-ATP wurde der Nachweis mittels phospho-affinem Phos-tag etabliert.