Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1978
Authors: Dias de Vasconcelos Almeida, Miguel Duarte
Title: Insights into the function and evolution of nematode RNAi pathways
Online publication date: 5-Jun-2019
Language: english
Abstract: Argonaute proteins bind small RNAs (sRNAs) and together regulate gene expression across all domains of life. Multiple sRNA pathways are involved in controlling selfish genetic elements, like transposable elements (TEs). The nematode Caenorhabditis elegans expresses multiple classes of sRNAs, including 21U-RNAs, which are considered the Piwi-interacting RNAs (piRNAs) of C. elegans, as well as 26G- and 22G-RNAs, which are primary and secondary endogenous small interfering RNAs (endo-siRNAs), respectively. GTSF1 proteins are evolutionarily conserved factors that are required for normal fertility and TE silencing in the animal germline, by physically interacting with Piwi Argonautes. Given the lack of conserved factors acting in the 21U-RNA/piRNA pathway, we wanted to dissect the role of the single GTSF-1 ortholog in C. elegans. To do this, we first created gtsf-1 mutants using CRISPR/Cas9 technology. We found that gtsf-1 mutants display fertility defects similar to its orthologs in mouse and flies. Surprisingly, we found that GTSF-1 is not required for TE silencing nor for 21U-RNA biogenesis or function. Instead, we have shown that GTSF-1 is required for the biogenesis of endo-siRNAs by interacting, via its CHHC zinc fingers, with the RNA-dependent RNA Polymerase RRF-3. Importantly, GTSF-1 is required for the assembly of the protein complex that assists RRF-3 in the biogenesis of endo-siRNAs. This work suggests that a common denominator of GTSF1 function may be to promote the assembly of multi-subunit effector complexes, in the context of sRNA pathways. Upon the genetic dissection of GTSF-1 function, we uncovered a remarkable maternal effect in the transmission of its mutant phenotypes. We used high-throughput sequencing and genetics to characterize the sRNA and target mRNA dynamics subjacent to this maternal effect. We found that primary endo-siRNAs are maternally deposited to initiate secondary endo-siRNA production, which, in turn, will exert target gene silencing throughout development. Furthermore, we explored additional aspects of gene regulation by endo-siRNAs. We have shown that two redundant paralog Argonaute proteins, termed ALG-3 and ALG-4, which interact with primary endo-siRNAs, fine-tune their own expression in a negative feedback loop. Moreover, we identified several determinants of the regulatory outcome of ALG-3/4 targets. The last facet of my PhD work concerns the characterization of GTSF-1 homologs in additional nematode species. We were driven to do so because of the apparent functional diversity of GTSF-1 proteins. To this end, we identified and mutated gtsf-1 homologs in C. briggsae and Pristionchus pacificus. We found that gtsf-1 is required for normal fertility in these two species, but is required for endo-siRNA biogenesis only in P. pacificus. Therefore, Cbr-GTSF-1 may not be required for the endo-siRNA pathway, in line with the robust evolutionary plasticity of GTSF-1 proteins.
Argonautenproteine binden kleine RNS-Sequenzen (small RNAs - sRNAs) und regulieren, gemeinsam mit diesen sRNAs, die Genexpression in allen Domänen des Lebens. Mehrere sRNA-Wege sind an der Kontrolle von eigennützigen genetischen Elementen, wie den transponierbaren Elementen (TEs), beteiligt. Der Nematode Caenorhabditis elegans exprimiert mehrere Klassen von sRNAs, welche die 21U-RNAs sowie die 26G- und 22G-RNAs einschließen. 21U-RNAs gelten als Piwi-interagierende RNAs (piRNAs) von C. elegans. Die 26G- und 22G-RNAs sind primäre beziehungsweise sekundäre endogene kleine interferierende RNAs (Endo-siRNAs). GTSF1-Proteine sind evolutionär konservierte Faktoren, die für die normale Fertilität und das TE-Silencing in der Keimbahn des Tieres erforderlich sind indem sie mit den Piwi-Argonautenproteinen interagieren. Angesichts des Mangels an konservierten Faktoren, die im 21U-RNA / piRNA-Weg wirken, wollten wir die Rolle des einzigen GTSF-1-Orthologen in C. elegans untersuchen. Zu diesem Zweck wurden zunächst gtsf-1-Mutanten mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie erstellt. Wir fanden heraus, dass gtsf-1-Mutanten Fertilitätsdefekte aufweisen, die den der Orthologen von Mäusen und Fliegen ähneln. Überraschenderweise stellten wir fest, dass GTSF-1 weder für das TE-Silencing noch für die 21U-RNA-Biogenese oder -Funktion benötigt wird. Stattdessen haben wir gezeigt, dass GTSF-1 für die Biogenese von Endo-siRNAs erforderlich ist, indem es über seine CHHC-Zinkfinger mit der RNA-abhängigen RNA-Polymerase RRF-3 interagiert. Zudem ist GTSF-1 an dem Aufbau des Proteinkomplexes beteiligt, der RRF-3 bei der Biogenese von Endo-siRNAs unterstützt. Diese Doktorarbeit deutet darauf hin, dass ein gemeinsamer Nenner der GTSF1-Funktion darin besteht, den Aufbau von großen Effektor-Komplexen im Zusammenhang mit sRNA-Wegen zu fördern. Bei der genetischen Untersuchung der GTSF-1-Funktion haben wir einen bemerkenswerten maternalen Effekt bei der Übertragung seiner Mutanten-Phänotypen entdeckt. Wir verwendeten Hochdurchsatz-Sequenzierung und genetische Ansätze, um die Dynamik der sRNA und der Ziel-mRNA zu charakterisieren, die diesem maternalen Effekt zugrunde liegen. Wir fanden heraus, dass primäre Endo-siRNAs maternal hinterlegt werden, um die Produktion der sekundären Endo-siRNA zu initiieren. Diese wiederum bewirken während der gesamten Entwicklung die Stilllegung des Zielgens. Darüber hinaus untersuchten wir weitere Aspekte der Genregulation durch Endo-siRNAs. Wir haben gezeigt, dass zwei redundante paraloge Argonautenproteine, ALG-3 und ALG-4, die mit primären Endo-siRNAs interagieren, ihre eigene Expression in einer negativen Rückkopplungsschleife kontrollieren. Darüber hinaus haben wir mehrere Faktoren zur Regulierung von ALG-3/4-Zielgenen identifiziert. Aufgrund der funktionellen Vielfalt der GTSF-1-Proteine, behandelt der letzte Teil dieser Doktorarbeit die Charakterisierung von GTSF-1-Homologen in weiteren Nematodenarten. Zu diesem Zweck haben wir gtsf-1-Homologe in C. briggsae und Pristionchus pacificus identifiziert und mutiert. Wir haben festgestellt, dass gtsf-1 für die normale Fertilität in diesen beiden Spezies erforderlich ist, für die Endo-siRNA-Biogenese allerdings nur in P. pacificus. Angesichts der robusten evolutionären Plastizität von GTSF-1-Proteinen, ist Cbr-GTSF-1 möglicherweise nicht erforderlich für den Endo-siRNA-Weg.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: Externe Einrichtungen
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1978
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: xviii, 184 Seiten
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