Authors:	Krumm, Andrea
Title:	Histone deacetylase inhibitors reverse resistance to methylating agents : mechanisms in malignant melanoma and glioblastoma cells
Online publication date:	15-Feb-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	The aggressive characteristics of metastatic melanoma and glioblastoma necessitate DNA-damaging therapies, in particular with methylating agents such as Temozolomide (TMZ) or Dacarbazine (DTIC). However, the efficacy of therapy is limited by resistance factors such as DNA repair, DNA damage signaling and impaired apoptosis execution. Histone deacetylase (HDAC) inhibitors have proven antineoplastic as they are associated with cell cycle and apoptosis regulation as well as with DNA repair. Therefore, this study investigated whether HDAC inhibition enhances the efficacy of DNA damaging therapies in malignant melanoma and glioblastoma cell lines as well as its influence on DNA damage-resistance pathways. First, it was shown that malignant melanoma cells express high levels of class I HDACs HDAC1, HDAC2 and HDAC3 in comparison to non-cancerous cells. Pre-treatment inhibition of these HDACs by valproic acid or Entinostat enhanced the apoptotic response of melanoma cells to the methylating agent TMZ, the chloroethylating agent Fotemustine and to ionizing radiation without sensitizing primary melanocytes. This work proposes that HDAC inhibition sensitizes melanoma cells to DNA damaging insults by downregulating proteins involved in homologous recombination (HR) repair of replication-dependently formed DNA double-strand breaks (DSBs), which leads to an increase in apoptosis. This is substantiated by the following observations obtained in this study: Inhibition of class I HDACs reduced the expression of the HR factors RAD51 and FANCD2 on transcript and protein level. The resulting functional impairment of HR decreased the repair of DSBs by this pathway and increased the sensitivity to PARP1 inhibition, which relies on HR derogation. Consequently, HDAC inhibition increased replication dependent DSB formation following TMZ exposure. The protective role of HR in melanoma TMZ toxicity was confirmed by RAD51 knockdown experiments. RAD51 knockdown cells were more susceptible to TMZ-induced apoptosis than the corresponding control lines. In glioblastoma cells, half of the tested cell lines exhibited increased TMZ-induced cell death in combination with the HDAC inhibitor Entinostat. The findings support a possible mechanism whereby HDAC inhibition disrupts DNA damage signaling in glioblastoma cells and alters the cell cycle regulation in response to TMZ, leading to apoptosis. TMZ treatment activated the DNA damage signaling kinases ATM/ATR, whereas in combination with Entinostat, ATM/ATR activation was abolished. Similarly, TMZ-induced downstream signaling to checkpoint kinases (CHK1/CHK2) as well as the following p53 stabilization and expression of the cell cycle regulator p21Cip1/Waf1 were abrogated in the presence of Entinostat. Further, HDAC inhibition protected from endoreplication upon TMZ-treatment and instead induced apoptosis in glioblastoma cells. In conclusion, this work demonstrates that class I HDAC inhibitors are DNA damage sensitizers in cancer cells. This HDAC inhibitor-mediated sensitization is due to the impairment of RAD51 and FANCD2 dependent HR repair in melanoma cells, or due to the premature shutdown of DNA damage signaling in glioblastoma cells. As inhibitors like valproic acid and Entinostat are well-tolerated in patients, the combination of adjuvant HDAC inhibition with methylating agents is a reasonable approach for improving therapeutic efficacy. Since acting on general DNA damage resistance pathways, HDAC inhibition might further provide a way for combination with genotoxic agents other than the common O6-alkylating, thereby circumventing the major resistance factor O6-methylguanine-DNA methyltransferase. Metastasierende Melanome und Glioblastome werden mit DNA-schädigenden Therapien behandelt, insbesondere mit den methylierenden Agenzien Temozolomid (TMZ) oder Dacarbazin. Die Effizienz dieser Therapien ist jedoch durch Resistenzmechanismen, wie DNA-Reparatur oder beeinträchtigter Apoptose-Induktion, limitiert. Die Inhibition von Histon-Deacetylasen (HDACs) wirkt potenziell antineoplastisch, da sie mit der Regulation von Zellzyklus, Zelltod und DNA-Reparatur in Verbindung gebracht wird. Daher untersucht die vorliegende Arbeit den Einfluss von HDAC-Inhibitoren auf die Sensitivität von malignen Melanom- und Glioblastomzellen gegenüber methylierenden Agenzien, sowie den Einfluss auf DNA-Reparatur, DNA-Schadensantwort und Apoptose-Induktion nach DNA-Alkylierung. Zunächst wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Melanomzelllinien eine höhere Expression der Klasse I HDACs HDAC1, HDAC2 und HDAC3 im Vergleich zu gesunden Zellen aufweisen. Die Hemmung dieser HDACs mit Valproinsäure oder Entinostat führte zu einer höheren Apoptose-Induktion in Melanomzellen nach Behandlung mit dem methylierenden Agens TMZ, mit dem chloroethylierenden Agens Fotemustin oder nach Bestrahlung, ohne primäre Melanozyten zu sensitivieren. Die HDAC-Inhibitor-vermittelte Sensitivierung basiert auf einer Reduktion der homologen Rekombinationsreparatur (HR), welche replikationsabhängig gebildete DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) repariert. Es wurde nachgewiesen, dass die HR-Faktoren RAD51 und FANCD2 durch HDAC-Inhibition auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert werden. Dies führte zu einer erniedrigten HR-DSB Reparatur und sensitivierte die Melanomzellen gegenüber PARP1-Inhibition, welche HR-geschwächte Zellen angreift. Außerdem erhöhte die HDAC-Inhibition die Induktion von DSBs durch TMZ. Die schützende Rolle der HR bei der Toxizität von TMZ in Melanomzellen wurde mithilfe eines Knockdown-Experiments illustriert, wobei RAD51-Knockdown Zelllinien eine höhere Empfindlichkeit gegenüber TMZ zeigten als Kontrollzelllinien. Die Hälfte der getesteten Glioblastomzelllinien wies eine erhöhte Apoptose-Induktion in einer Kombination von TMZ mit dem HDAC-Inhibitor Entinostat im Vergleich zur alleinigen TMZ-Behandlung auf. Die gewonnenen Daten legen eine fehlerhafte DNA Schadensantwort durch HDAC-Inhibition nahe, welche die Regulation des Zellzyklus beeinflusst und Apoptose induziert. So wurde gezeigt, dass TMZ die Kinasen ATM und ATR aktiviert, was in Kombination mit Entinostat ausbleibt. Ebenfalls wurden die nachgeschalteten Checkpoint-Kinasen (CHK1, CHK2) in Anwesenheit des Inhibitors weniger aktiviert. Somit wurde auch kein p53 stabilisiert und der Zellzyklusregulator p21Cip1/Waf1 nicht vermehrt exprimiert. Weiterhin blieb die TMZ-induzierte Endoreplikation in Kombination mit Entinostat in Glioblastomzellen aus, an deren Stelle die Apoptose-Induktion trat. Zusammenfassend demonstriert diese Arbeit, dass HDAC-Inhibitoren Krebszellen gegenüber DNA-Schäden sensitivieren. In Melanomzellen geschieht dies durch die Beeinträchtigung der HR und in Glioblastomzellen durch eine Störung der Schadensantwort. Da HDAC-Inhibitoren wie Valproinsäure und Entinostat gut verträglich sind, stellen sie als Adjuvans zur Therapie mit methylierenden Agenzien eine Möglichkeit zur Verbesserung des Therapieerfolges dar. Da HDAC-Inhibitoren auf die HR und Schadensantwort wirken, die auch Resistenz gegenüber weiteren DNA-schädigenden Therapeutika vermitteln, könnte mit dem Einsatz von Agenzien, die nicht auf O6-Alkylierung basieren, O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase als ein Hauptresistenzfaktor umgangen werden.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1963
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000002482
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	114 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen