Authors:	Etzold, Anna
Title:	Molekulargenetische und zellbiologische Charakterisierung primärer Fibroblasten einer Patientin mit konstitutiver BRCA1-Epimutation und multiplen Neoplasien im isogenen Zwillingsvergleich
Online publication date:	5-Feb-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	BRCA1 (BReast CAncer 1, early-onset) ist ein Tumorsuppressorgen und kodiert für ein multifunktionelles Protein, das an der Erhaltung der genomischen Integrität beteiligt ist. BRCA1-Keimbahnmutationen sind mit einer erblichen Form von Brust- und Eierstockkrebs sowie mit erhöhtem Risiko für eine Vielzahl weiterer Tumorentitäten assoziiert. Konstitutionelle Epimutationen des BRCA1-Gens werden analog zu Sequenzmutationen als „Erster Hit“ im Sinne der Knudson-Hypothese und als krebsdisponierender Faktor diskutiert. Unter Berücksichtigung neuster wissenschaftlicher Erkenntnisse, die eine entscheidende Rolle der stromalen Mikroumgebung für die Krebs-Disposition, -Initiation und Progression belegen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die biologischen Konsequenzen einer BRCA1-Haploinsuffizienz in nicht-neoplastischen Zellen mesenchymalen Ursprungs untersucht. Hierfür wurden primäre dermale Fibroblasten (BRCA1mosMe) einer Patientin mit lebenszeitlich früh aufgetretenen Neoplasien sowie einer konstitutionellen BRCA1-Epimutation auf transkriptioneller und zellbiologischer Ebene charakterisiert und mit isogenen Kontrollfibroblasten (BRCA1wt) der gesunden monozygoten Zwillingsschwester verglichen. Eine Microarray-basierte komparative Expressionsanalyse identifizierte 285 zwischen BRCA1mosMe und BRCA1wt Fibroblasten differenziell exprimierte Gene. Überrepräsentiert waren vor allem Gene, die für extrazelluläre Strukturproteine (z.B. COL11A1, COL5A1, FLG, KRT19), mit der extrazellulären Matrix assoziierte Faktoren (z.B. ADAM12, LOXL2, PLOD2), sowie protumorigene Wachstumsfaktoren und Chemokine (z.B. IL6, CXCL12, CXCL6, FGF5) kodieren. Der explorative Vergleich des generierten BRCA1mosMe-Expressionsprofils mit bereits publizierten Expressionsdaten verschiedenster Zelltypen identifizierte eine starke Analogie zu der transkriptionellen Signatur von sogenannten CAFs (Cancer associated fibroblasts). BRCA1mosMe Fibroblasten zeigten im Vergleich zu BRCA1wt Fibroblasten veränderte zellbiologische Eigenschaften, unter anderem eine verstärkte Proliferation, Migration sowie eine abnorme Aktinarchitektur, die sich durch die vermehrte Existenz von Aktin-Stressfasern darstellte. Eine im Vergleich zu BRCA1wt erhöhte Konzentration des Ketonkörpers β-Hydroxybutyrat im Zellkulturüberstand der BRCA1mosMe Fibroblasten deutete auf metabolische Veränderungen zu Gunsten einer aeroben Glykolyse hin. Darüber hinaus wirkte konditioniertes Medium der BRCA1mosMe Fibroblasten in vitro deutlich stärker proliferationsfördernd auf die Epithelial- bzw. Krebszelllinien HMLE und A549 als dies für die Kontrollfibroblasten der Fall war. Die Ergebnisse zeigen, dass BRCA1mosMe sich transkriptionell, zellbiologisch und funktionell in gleicher Weise von BRCA1wt Fibroblasten unterscheiden wie tumornah entnommene CAFs von normalen Fibroblasten. CAFs sind Zellen der Tumormikroumgebung und fördern sowohl parakrin durch Sekretion tumorigener Substanzen als auch durch Modifikation der extrazellulären Matrix (EZM) deren Wachstum. Die primäre Existenz oder Ko-Evolution von angrenzenden Tumorzellen galt lange Zeit als Voraussetzung für die Genese von CAFs. Aktuelle Studien konnten jedoch zeigen, dass normale Fibroblasten in vitro in kompletter Abwesenheit von Krebszellen, CAF-typische phänotypische und funktionelle Eigenschaften annehmen können, wenn durch einen shRNA-Knockdown die Expression eines der Tumorsuppressorgene BRCA1, RB, TP53 oder PTEN reduziert wird. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten belegen, dass ein CAF-ähnlicher Zustand in nicht-tumorösen mesenchymalen Zellen vorhanden sein kann und in dem untersuchten Fall mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die konstitutionelle BRCA1-Epimutation zurückzuführen ist. Konstitutionelle Veränderungen der stromal-epithelialen Interaktionen zugunsten einer Tumor-fördernden Mikroumgebung in genetisch krebsprädisponierten Individuen können einen Aspekt des bis heute nicht vollständig aufgeklärten Pathomechanismus von BRCA1-Mutationen bei der erblichen Tumorgenese darstellen. Das Wissen um die mesenchymale Beteiligung bei der hereditären Kanzerogenese birgt das Potenzial, gezielte chemopräventive Maßnahmen zu entwickeln, die durch Regulation der abnormen stromalen Konstitution in Individuen mit BRCA1-Mutationen die Initiation der Krebserkrankung verzögern oder verhindern können. BRCA1 is a tumor suppressor gene, that when mutated is responsible for a strong cancer predisposition in particular for the hereditary forms of early-onset breast and ovarian cancers. Constitutional epimutations of tumor suppressor genes are increasingly considered as first hits according to Knudson´s hypothesis equally to sequence mutations. Given the emerging role of the microenvironment for cancer predisposition, initiation, and progression, the aim was to characterize the consequences of BRCA1 haploinsufficiency in stromal cells of mesenchymal origin. Primary dermal fibroblasts (BRCA1mosMe) from a patient with recurrent cancers harboring a BRCA1 mosaic epimutation were studied on the molecular and cellular level and compared to isogenic control fibroblasts (BRCA1wt) taken from the patient´s healthy monozygous sister. Transcriptome analysis identified 285 genes which were differentially expressed between BRCA1mosMe and BRCA1wt fibroblasts. Of those, a large portion were genes coding for extracellular structure proteins (e.g. COL11A1, COL5A1, FLG, KRT19), other extracellular matrix associated factors (e.g. ADAM12, LOXL2, PLOD2) as well as protumorigenic growth factors and chemokines (e.g. IL6, CXCL12, CXCL6, FGF5).An explorative literature search comparing the BRCA1mosMe expression profile to data that had been reported for different cell types before identified a massive concordance to the expression signature of so-called cancer-associated fibroblasts (CAFs). Further analysis detected CAF-typical cellular features including an elevated growth rate, accelerated migration, altered actin architecture, and increased production of ketone bodies in BRCA1mosMe fibroblasts compared to BRCA1wt fibroblasts. In addition, conditioned medium of BRCA1mosMe fibroblasts was more potent than conditioned medium of BRCA1wt fibroblasts to promote cell proliferation in an epithelial and a cancer cell line. CAFs are the major part of the tumor stroma and promote tumor growth by secretion of tumorigenic substances and through modification of the ECM. In contrast to the previous scientific conviction new experimental evidence indicates that the CAF phenotype can develop in absolute absence of tumor cells, in fact from normal fibroblasts by depletion of tumor suppressor genes in vitro. The data reveals that a CAF-like state can also exist in healthy tissue with a tumor suppressor deficiency, in this case through a BRCA1 epimutation. Building a favorable environment for cancer development by CAF-like fibroblasts may be one mechanism by which cancer proneness is caused in individuals with germline or constitutional BRCA1 disruption. If this concept is proven to be generally applicable to mesenchymal cells with BRCA1 mutations, it may open completely new perspectives on hereditary BRCA1-related carcinogenesis and trigger new impulses for the development of novel preventive strategies.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1956
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000002232
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	164 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen