Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1872
Authors: Thomas, Meike
Title: Leishmania major promastigote entry of an autophagy-like compartment and amastigote escape from the parasitophorous vacuole
Online publication date: 1-Jul-2015
Language: english
Abstract: In this thesis, we investigated the interaction of the obligate intracellular parasite Leishmania (L.) major with two phenotypes of human monocyte derived macrophages (hMDMs). Thereby we focused on the development and maturation of the parasitophorous vacuole (PV) and could show that compartment development is dependent on the parasite stage.rnFocusing on the ultrastructure of PVs containing axenic amastigotes, we demonstrated that the parasites are partially located in damaged PVs or in the cytoplasm of the host. Moreover, we visualized multiple amastigotes in a common PV 144 h p.i. in pro-inflammatory hMDM I but not in anti-inflammatory hMDM II indicating different PV development. rnRegarding the promastigote form, we demonstrated a different uptake of viable and apoptotic L. major promastigotes by hMDMs. Viable promastigotes are predominantly taken up via the flagellum tip whereas apoptotic promastigotes enter the cells via the parasite body. Analyzing compartment maturation, we found that 20-30% of the PVs get positive for the early maturation markers PI3P and EEA1 independent of the viability of the parasites and unaffected by the human macrophage type. Subsequently, 25-40% of the parasites acquire the autophagy marker LC3 on their PV, what is independent of the viability of the parasites as well. We quantified this and in hMDM II less LC3-positive compartments formed compared to hMDM I. Analyzing the ultrastructure, we investigated that the compartments consist of a single-membrane PV characteristic for LC3-associated phagocytosis (LAP). Involvement of LAP was confirmed by demonstrating that the protein kinase ULK1 is dispensable for LC3-compartment formation around Leishmania PVs. Visualizing compartment dynamics in real time showed that apoptotic promastigotes are degraded in LC3-positve compartments, whereas viable promastigotes are able to get rid of LC3-protein on their PV suggesting an involvement in parasite development and survival. In this thesis, we established a lentiviral based fluorescent imaging technique that we combined with High-Pressure-Freezing (HPF) and high-resolution 3D electron microscopy. We visualized a promastigote in a LC3-compartment whose ultrastructure showed an opening of the PV to the outside. To identify new LAP markers involved in Leishmania infection, we established an immuno-magnetic isolation protocol for the purification of Leishmania containing compartments.rnIn conclusion, this study suggests that L. major compartment biogenesis and maturation in pro- and anti-inflammatory human macrophages is dependent on the parasite stage and is different between axenic amastigotes, viable promastigotes and apoptotic promastigotes. Understanding the development and maturation of Leishmania parasites in human host cells is important to control and combat the neglected disease leishmaniasis in the future.rn
In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion des obligat intrazellulären Parasiten Leishmania (L.) major mit zwei unterschiedlichen Phänotypen von humanen Makrophagen untersucht. Der Fokus lag dabei auf der Charakterisierung der Entwicklung und Reifung der parasitophoren Vakuole (PV) und es konnte gezeigt werden, dass die Lebensform des Parasiten einen Einfluss auf die Kompartimententwicklung in der Wirtszelle hat.rnDie Untersuchung der Ultrastruktur der PV von axenischen L. major Amastigoten hat gezeigt, dass die Parasiten teilweise in beschädigten Kompartimenten oder im Zytoplasma der Wirtszelle lokalisiert sind. Zudem konnten in pro-inflammatorischen Makrophagen 144 h nach Infektion mehrere Amastigoten in einem gemeinsamen Kompartiment visualisiert werden, was auf eine unterschiedliche Entwicklung der PV in pro- und anti-inflammatorischen Makrophagen hindeutet.rnBezüglich der promastigoten Lebensform konnten wir darlegen, dass lebende Promastigoten überwiegend über ihre Geißel und apoptotische Promastigoten mit dem Parasitenkörper voran von humanen Makrophagen aufgenommen werden. Bei der Untersuchung der Kompartimentreifung haben wir herausgefunden, dass 20-30% der PV positiv für die frühen Maturationsmarker PI3P und EEA1 werden. Dies ist unabhängig von der Viabilität der Parasiten sowie vom Makrophagentyp. Anschließend erlangen, ebenfalls unabhängig von der Viabilität, 25-40% der Parasiten den Autophagiemarker LC3 auf ihrer PV. Quantifizierungen haben ergeben, dass sich in anti-inflammatorischen Makrophagen weniger LC3-positive Kompartimente bilden als in pro-inflammatorischen Makrophagen. Untersuchungen auf Ebene der Ultrastruktur haben zudem gezeigt, dass die Kompartimente aus einer Einzelmembran bestehen, die charakteristisch für LC3-assoziierte Phagozytose (LAP) ist. Die Beteiligung des LAP Signalweges konnte mit Hilfe der Proteinkinase ULK1, die nicht für die Rekrutierung von LC3-Proteinen zu Leishmanien-Kompartimenten benötigt wird, bestätigt werden. Mit Hilfe von Live Cell Imaging Experimenten wurde deutlich, dass apoptotische Promastigoten in LC3-positiven Kompartimenten abgebaut werden. Im Gegensatz dazu wird die PV von lebenden Promastigoten mit der Zeit LC3-negativ, ohne dass dabei der Parasit abgebaut wird, was auf eine Funktion während der Entwicklung des Parasiten hindeutet. Die in dieser Arbeit etablierte lentivirale Transduktion von primären Makrophagen als Tool für fluoreszenzmikroskopische Analysen des Infektionsprozesses, wurde mit der Methodik des Hochdruckgefrierens und mit 3D Elektronenmikroskopie kombiniert. Dabei konnte ein Parasit in einem LC3-positiven Kompartiment visualisiert werden, dessen PV in der Ultrastruktur einen Kanal zum extrazellulären Raum aufweist. Um neue LAP-Marker zu identifizieren, wurde ein immuno-magnetisches Isolationsprotokoll für die Aufreinigung von Leishmanien enthaltenen Kompartimenten etabliert.rnZusammenfassend legen die Ergebnisse dieser Dissertation nahe, dass die Entstehung und Reifung der L. major PV in pro- und anti-inflammatorischen humanen Makrophagen abhängig von der Lebensform des Parasiten ist und somit bei axenischen Amastigoten sowie lebenden und apoptotischen Promastigoten unterschiedlich vermittelt wird. Das Verständnis über die Entwicklung und Reifung von Leishmanien in humanen Wirtszellen trägt entscheidend dazu bei, die vernachlässigte Krankheit Leishmaniose in der Zukunft zu kontrollieren und bekämpfen zu können. rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1872
URN: urn:nbn:de:hebis:77-40944
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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