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Authors: Spang, Natalie
Title: RAB3GAP1 und RAB3GAP2 (RAB3 GTPase-activating Protein 1/2) beeinflussen die Autophagie in C. elegans und humanen Zellen
Online publication date: 12-Jun-2015
Language: german
Abstract: Die Proteinhomöostase wird in der Zelle von drei Stoffwechselwegen reguliert: den molekularen Chaperonen, dem Ubiquitin-Proteasom-System und dem autophagosomalen Abbauweg. Die (Makro)Autophagie verpackt und transportiert zytosolische Komponenten in Autophagosomen zu den Lysosomen, wo sie abgebaut werden. Eine Störung dieses Abbauwegs wirkt auf die Proteostase.\r\nIn dieser Dissertation wurde C. elegans als Modellorganismus zur Erforschung von Proteinstabilität genutzt. In einer RNAi-vermittelten Proteostase-Analyse von Chromosom I und ausgewählter zusätzlicher Gene wurde ein Wurmstamm, der ein Luc::GFP-Konstrukt im Muskel exprimiert, genutzt. Dieses Reporterprotein aggregiert unter Hitzestressbedingungen und diese Aggregation kann durch Modulatoren der Proteostase beeinflusst werden. Dabei wurden mögliche neue Faktoren der Proteinhomöostase entdeckt. Durch weitere Experimente bei denen die Aggregation von PolyQ35::YFP im AM140-System, der Paralyse-Phänotyp und die Akkumulation Thioflavin S-gefärbter Aggregate von Aβ42 im CL2006-Wurmstamm und die Effekte auf die Autophagie mittels eines GFP::LGG1-Konstrukt analysiert wurden, konnten rbg-1 und rbg-2 als neue Modulatoren der Proteinhomöostase, insbesondere der Autophagie, identifiziert werden.\r\nIm Säuger bilden beide Orthologe dieser Gene, RAB3GAP1 und RAB3GAP2 den heterodimeren RAB3GAP-Komplex, der bisher nur bekannt war für die Stimulation der Umwandlung der GTP-gebundenen aktiven Form zur GDP-gebundenen inaktiven Form der RAB GTPase RAB3. In Immunoblot-Analysen und mikroskopischen Darstellungen im Säugersystem konnte gezeigt werden, dass die Effekte auf die Proteostase über den autophagosomalen Abbauweg wirken. RAB3GAP1/2 wirken als positive Stimulatoren, wenn die Lipidierung von LC3-I und der autophagische Flux von LC3-II und p62/SQSTM1 betrachtet werden. Diese Effekte werden aber nicht über die RAB GTPase RAB3 vermittelt. Die Proteine FEZ1 und FEZ2 haben einen antagonistischen Effekt auf die Autophagie und wenn alle vier Komponenten RAB3GAP1, RAB3GAP2, FEZ1 und FEZ2 zusammen herunter- oder hochreguliert werden, heben sich diese Effekte auf. In Co-Immunopräzipitationen und proteomischen Analysen konnte keine direkte Interaktion zwischen dem RAB3GAP-Komplex und FEZ1/2 oder zu anderen Autophagie-Genen nachgewiesen werden.\r\nHier konnte der RAB3GAP-Komplex funktionell mit Proteostase und Autophagie in C. elegans und Säugerzellen assoziiert werden. Dieser Komplex zeigt Einflüsse auf die autophagosomale Biogenese indem sie die Proteostase und die Bildung von (prä)autophagosomalen Strukturen in C. elegans und die Lipidierung von LC3 und damit den autophagischen Flux der Autophagiesubstrate LC3-II und p62/SQSTM1 in Säugerzellen beeinflusst. Darüber hinaus wirkt RAB3GAP der komplexen Autophagie-Unterdrückung durch FEZ1 und FEZ2 entgegen. Somit konnte gezeigt werden, dass RAB3GAP als neuartiger Faktor auf die autophagosomale Biogenese und somit auf die Proteostase wirkt.\r\n
Protein homeostasis in living cells is regulated by three metabolic pathways: molecular chaperones, the ubiquitin-proteasome system, and the autophagosomal degradation pathway. (Macro)Autophagy sequesters and transports cytosolic cargo in autophagosomes to lysosomes, where the cytosolic components are degraded. A disorder of this catabolic pathway affects proteostasis.\r\nIn this dissertation C. elegans has been used as a model organism for the study of protein stability. In a RNAi-mediated proteostasis analysis of chromosome I and selected additional genes a worm strain expressing a Luc::GFP construct in muscle cells was used. This reporter protein aggregates under heat stress conditions and this aggregation may be affected by modulators of proteostasis. These possible new factors of protein homeostasis were discovered by further experiments. In this studies the aggregation of PolyQ35::YFP in C. elegans AM140 system, the paralysis phenotype and accumulation of thioflavin S-stained aggregates of Aβ42 in CL2006-worms, and the effects on autophagy using a GFP::LGG1 were analyzed. These investigations were able to identify rbg-1 and rbg-2 as new modulators of protein homeostasis, and in particular of autophagy. \r\nThe mammalian orthologs of these genes (RAB3GAP1 and RAB3GAP2) form the heterodimeric complex RAB3GAP, which was previously just known for the stimulation of the conversion of the active GTP-bound form to the inactive GDP-bound form of the RAB GTPase RAB3. Both proteins could be further investigated in the mammalian system using immunoblot analysis and microscopic illustrations. It was shown that the effects on the proteostasis were mediated by the autophagosomal degradation pathway. If the lipidation of LC3-I and the autophagic flux of LC3-II and p62/SQSTM1 be considered, RAB3GAP1/2 act as positive stimulators on autophagy. These effects are not mediated by the RAB GTPase RAB3. Moreover, we analyzed RAB3GAP1/2 in relation to the previously reported suppressive autophagy modulators FEZ1 and FEZ2 and demonstrate that both reciprocally regulate autophagy. It was shown no direct interaction between the RAB3GAP complex and FEZ1/2 or other autophagy genes in co-immunoprecipitation and proteomic analyzes.\r\nHere the RAB3GAP complex could be functionally associated with proteostasis and autophagy in C. elegans and mammalian cells. Rbg-1 and rbg-2 shows effects on the autophagosomal biogenesis by impact on proteostasis and formation of (pre) autophagosomal structures in C. elegans, and RAB3GAP1/2 in mammalian cells affects the lipidation of LC3 and thereby the autophagic flux of the autophagic substrates LC3-II and p62/SQSTM1. In addition RAB3GAP counteracts the complex autophagy suppression by FEZ1 and FEZ2. In conclusion, this dissertation identifies RAB3GAP1/2 as novel conserved factors of the autophagy and proteostasis network. \r\n
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1854
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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