Authors:	Gietzen, Sabine
Title:	Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie
Online publication date:	7-May-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Polymere Wirkstoffsysteme gewinnen im Bereich der biomedizinischen Forschung immer größeres Interesse. Vielversprechende Systeme für die Entwicklung von neuartigen Krebs-immun¬therapien stellen insbesondere Polymer-Konjugate dar. Das ideale Polymer-Konjugat besitzt eine Größe zwischen 10 nm und 100 nm, ist nicht zytotoxisch und zeigt keine Aggregation in humanem Blutserum. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie behandelt. Erstes Ziel der Arbeit war es, geeignete polymere Trägersysteme für die in vivo Anwendung zu finden. Hierzu wurde zunächst die Stabilität verschiedener potentieller polymerer Träger-systeme (Nanohydrogele, Succinyliertes-Poly-L-Lysin (Bürste), ELP-Bürsten und Poly(2-oxazolin)bürsten) in humanem Serum untersucht. Weiterhin wurde die unspezifische Zellaufnahme in murinen dendritischen Zellen (DCs) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem neutrale bzw. zwitterionische Partikel eine hohe Serumstabilität sowie keine unspezifische Zellaufnahme zeigen. Um eine gezielte Adressierung der DCs des Immunsystems zu erreichen und dadurch eine Immunantwort gegenüber einem bestimmten Krebs Zelltyp zu induzieren, wurden Biokonjugate - auf Basis der Succinylierten-Poly-L-Lysin-(Bürste) sowie der Azid-funktionalisierten Poly(2-oxazolin)bürste (POx) – entwickelt, da diese Polymerbürsten keine bzw. kaum unspezifische Aufnahme in DCs zeigen. Hierbei diente der Antikörper aDEC205 der gezielten Adressierung von CD8+ DCs. Die weiteren bioaktiven Komponenten waren das tumorassoziierte Antigen (TAA) mit der Kernsequenz SIINFEKL zur Induktion einer spezifischen Immunantwort sowie der immunaktivierende TLR9 Ligand, CpG1826. Die Komponenten wurden nacheinander an die Fluoreszenz-markierten Polymere kon¬jugiert. Die Konjugation des Antikörpers erfolgte nach vorangegangener DIBO-Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. Mit einer optimierten Aufarbeitungsmethodik gelang es, aggregat-freie, unimere DIBO-modifizierte aDEC205 Antikörper zu isolieren. Für die succinylierten Poly-L-Lysine konnten keine eindeutigen sowie reproduzierbaren Ergebnisse erhalten werden, sodass sich im weiteren Verlauf der Arbeit auf die POx konzentriert wurde. Die Konjugation von aDEC205 an POx wurde mittels verschiedener physiko-chemischer Methoden (UV-VIS, SDS-PAGE, FCS, GPC, CLSM und FACS) gezeigt. Mit Hilfe von „Specific-Hybridization-Internalisation-Sensor“ Experimenten konnte eine spezifische Aufnahme des Konjugats in CD8+ DCs nachgewiesen werden. rnDie Konjugation von Antigen und CpG erfolgte ebenso nach entsprechender Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. SDS-PAGE, UV-VIS und FCS bestätigten eine erfolgreiche Kopplung. T-Zell-Proliferationsversuche ergaben für Antigen enthaltende Polymer-Konjugate eine CD8+ T-Zell-Aktivierung. Des Weiteren zeigten die POx keine bemerkenswerte Toxizität und deren Konjugate keine Aggregation in humanem Serum. rnrnDarüber hinaus wurde der Einfluss verschiedener Polymertopologien auf ihre Biodistribution sowie Blutzirkulation untersucht. Für die nach GPC-Fraktionierung erhaltenen verschiedenen Polymerfraktionen - hochmolekulare wurmartige Polymerbürsten, ellipsoidartige Polymer-bürsten und niedermolekulare kugelförmige Moleküle - konnten vielversprechende Ergebnisse erhalten werden. rnIn the last decades polymer therapeutics have been widely investigated as polymeric bioconjugates proved to be promising candidates for the development of novel cancer immunotherapeutics. The ideal polymeric bioconjugate has a size range between 10 and 100 nm, is not cytotoxic and shows no aggregation behavior in human blood serum.rnrnThe present work investigates the synthesis and characterization of polymer-drug-antibody conjugates and their application in cancer immunotherapy.rnThe first aim was it to identify appropriate polymeric carriers for in vivo applications. For this purpose, first the stability in human serum of different potential polymers (nanohydrogels, succinylated poly-L-lysine(brushes), ELP-brushes and poly¬¬(2-oxazoline)¬¬brushes) was in-vestigated and the unspecific uptake in murine dendritic cells (DCs) was analysed. It has been demonstrated, that most notably neutral/zwitterionic particles are stable in human serum and are not internalized by DCs.rnrnA bioconjugate was developed that is designed to target DCs of the immune system and to induce an immune response against a certain type of cancer cells. rnThese systems consist of succinylated poly-L-lysines or azide-functionalized poly(2-oxazoline)brushes (POx), because they show no or marginally unspecific uptake in cells. Specific cell targeting is achieved via the DEC205 receptor (CD8+) for the antiDEC205 antibody. The bioactive components additionally conjugated to the same polymer chain are a tumor associated antigen (TAA) with the core peptide sequence SIINFEKL inducing a specific immune response and also an immune-activating TLR9 ligand, CpG1826.rn rnThe components were conjugated sequentially to fluorescently labeled polymers for in vitro studies. AntiDEC205 antibody was covalently attached to the polymer after being modified with the heterobifunctional crosslinker DIBO-NHS via copper-free click chemistry. With an optimized method it was possible to isolate DIBO-modified antibody aDEC205, which was monomeric and free of aggregates. For the succinylated poly-L-lysines no explicit and reproducable results could be achieved. Thus in the further course of this work POx was used as polymeric carrier. Successful conjugation of aDEC205 was shown by different physico-chemical methods (UV-VIS, SDS-PAGE, FCS, GPC, CLSM and FACS) and with “specific-hybridization-internalisation-sensor”-experiments a specific uptake in CD8+ DCs was demonstrated. rnFluorescently labeled antigen-representing peptide and CpG1826 were end-functionalized by DBCO and linked to POx via copper-free azide coupling prior to AntiDEC205 conjugation. SDS-PAGE, UV-VIS and FCS indicated successful coupling. T-cell proliferation assays show an activation of CD8+-T-cells for conjugates containing antigen. rnFurthermore, the POx brushes showed no remarkable cytotoxicity and their conjugates did not aggregate in human blood serum.rnrnMoreover the influence of different polymer topologies on the biodistribution and blood circulation times was investigated. For the different polymer fractions – high molecular weight wormlike brushes, ellipsoids and the low molecular weight spheres – promising results could be achieved.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1834
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-40464
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen