Authors:	Hirsch, Markus
Title:	Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells
Online publication date:	12-May-2015
Year of first publication:	2015
Language:	english
Abstract:	RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn RNAi is a powerful tool for gene function analysis and promises high potential for therapeutic application. While in cell culture models efficient knockdown rates can be achieved, applications in vivo remain challenging. Especially the delivery of siRNA into the target tissue or cells and a progressing degradation of siRNA are the major hurdles for therapeutic application. rnLabeled siRNA can be used for both, observing cellular localization and analyzing the integrity level of the applied siRNA. Two dyes attached to each strand of an siRNA duplex, i.e. the donor on the 3’-end of the sense strand and the acceptor on the 5’-end of the antisense strand, create a robust FRET system (Hirsch et al. 2012). The ratio of FRET to donor emission, the R/G ratio, serves as a sensitive classifier to determine the integrity level of duplex siRNAs (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). With this system, siRNA degradation of less than 5 % can be determined in either the cuvette or in living cells.rnThe presented research deals with the evaluation of potential FRET dye pairs regarding their suitability for in vitro and in vivo application. Several new FRET pairs have been evaluated covering the whole range of the visible light spectrum. This allows the selection of a FRET dye pair, compatible with other fluorescence labels or a certain test system.rnOn basis of Alexa555/Atto647N siRNA the successful formulation of liposomes containing siRNA was surveyed. A subsequent evaluation of different nanoparticular delivery systems identified liposomes, nanohydrogels and cationic peptides as systems with an excellent protective effect. With these results those delivery systems can now be further optimized for successful cellular delivery.rnAtto488/Atto590 siRNA proved to be ideal for integrity measurements in real-time in living cells. Enhanced photophysical properties, i.e. resistance to photobleaching and minimal spectral crosstalk, allowed the observation of transfected cells for up to 8 hours. With help of Atto488/Atto590 siRNA the delivery and the release process of cells transfected by cationic lipids was investigated in real-time, enabling the analysis of single release events, regarding release process and cellular distribution. rnAn initial strong release phase could be determined directly after transfection and was followed by a moderate and constant release rate over the rest of the observed time period. The average residence time of siRNA in the cytosol ranged around 24 and 58 min differentiating in long and short lasting release events. An import of siRNA into the nucleus could be observed, although, the time point of entrance was not yet determinable. The whole release process occurred spontaneously and changes in cellular distribution could be monitored within few minutes. Additionally, the released siRNA was cleared from the cytoplasm over time, leaving only small aggregates inside the cells that, however, displayed still siRNA at low integrity state.rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1826
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-40356
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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