Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-1751
Authors: Sommer, Maria
Title: Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln
Online publication date: 8-Oct-2013
Language: german
Abstract: In dieser Arbeit wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt für die Analyse von humanen DCs in vivo. Darüber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgeführt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) Mäuse verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Darüber hinaus waren myeloide DC-Vorläuferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsständigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zwölf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgrößen getestet. IL-7 führte zu keiner veränderten Hämatopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs führte. Darüber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor für den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. Für die in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten Mäusen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalität der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalität erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu früheren Zeitpunkten als Zielzellen für die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den Rückgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erwähnen ist, dass das Anwachsen einer humanen Hämatopoese stark spenderabhängig ist und somit keine allgemeingültigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden können. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Größe von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zusätzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalität von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizität bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberflächenmoleküle nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molekülen führte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht veränderten Expression von Oberflächenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten primär in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane Hämatopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es möglich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalität humaner DCs in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die Möglichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.
Aim of this work was the establishment of a humanized mouse model to study human DCs in vivo. Furthermore first experiments with functionalized nanoparticles had been performed. rnWe used immunosuppressed NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) mice which were transplanted with human CD34-purified peripheral blood stem cells (PBSCs). 14 different models were tested with a reconstitution rate of 76 %. From week 6 on, we found engrafted human CD45-positive cells in bone marrow, spleen and peripheral blood. We could also found human B cells, NK cells as well as CD14-positive monocytes. With regard to the reconstitution of human antigen-presenting cells (APCs), we observed myeloide precursors, next to conventional and plasmazytoid dendritic cells (DCs). T cells could not be detected before week 18 post transplantation. To check for tissue resident DCs, we stained biopsies and found human Langerhans cells (LC) in murine skin. This APC subset could be detected for up to 36 weeks post transplantation.rnTo optimize the reconstitution of DCs, we tested the supplementation with different cytokines. Human IL 7 showed no impact on the reconstitution, whereas human Flt3L led to in an increase of human CD14-positive monocytes, cDCs and pDCs and a marked reduction of human B cells.rnIn the first functional studies, allo-reactive CD8-positive T cells from a third party donor were generated by mixed-lymphocyte reaction and injected into humanized mice. The effect of these T cells on human hematopoiesis should be measurably by depletion of specific cell populations in the humanized mice. B cells seemed to be the main targets. Using mice beyond week 12 post transplantation, we also found evidence that myloid cells were also depleted.rnTo manipulate residual APCs, different approaches can be used.rnWithin this work, polystyrene-based nanoparticles were tested for their potential use in our humanized mouse model. The used nanoparticle showed a size of 80 to 160 nm and were triple-loaded with Platinum, BODIPY (flow cytometry, LSM) and an IRdye (in vivo imaging). LSM analysis revealed that most of the particles could be found intracytoplasmatic of DCs. The carboxy-functionalized particle showed almost no toxic effects, whereas the other particles became more toxic with higher concentrations. The expression of diverse DC-specific markers showed no change after loading with the particles. Testing the nanoparticle-loaded DCs in an IFN-gamma ELISpot revelead no differences in antigen-presentation compared to unloaded DCs.rnThe in vivo analysis showed a continuous circulation of all particles for up to 96 h. All particles could be found predominantly in the liver of the animals. First studies in the humanized mouse model showed no effect of human hematopoiesis on the distribution pattern and kinetics of injected nanoparticles.rnThe established mouse model enables studies on the development, differentiation, activation, and function of human DCs in vivo. Our model will help to study DC-targeting strategies in vivo for antigen delivery in vaccine strategies as well as manipulating DCs in regulatory processes.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1751
URN: urn:nbn:de:hebis:77-35288
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 142 S.
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