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Authors: Reuter, Anika
Title: Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates
Online publication date: 8-Oct-2013
Language: english
Abstract: Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Größe und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Präsentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDafür wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gewählt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinbürste (PLL-Bürste). Es wird vermutet, dass die PLL-Bürste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im Körper und eine verlängerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antikörper (aDEC205) für die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL für die Spezifität der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Trägermolekül deutlich höher erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinbürste zu übertragen. Anhand dieser polymeren Träger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Knäuels und der Bürste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschließend wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antikörpers mit PLL und anschließender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tikörpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-Bürste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizität bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL Bürsten-Konjugate keine ausgeprägte Zytotoxizität aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabhängi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringfügig erhöhte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antikörper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem â Specific Hybridization Internalization Sensorâ (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch über Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antikörper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. Lösliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit möglich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Träger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Größe, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Außerdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-Bürste übertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Präsentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antikörpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien für die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.
The aim of this thesis was to study polymeric bioconjugates and their application in cancer immunotherapy. Two different polymeric carriers were investigated, linear poly-L-lysine (PLL) and a polylysine brush (PLL brush). The PLL brush was expected to exhibit better body distribution than the linear polymer and prolonged circulation time in the blood stream due to its anisotropic shape. To impart biological function, three bioactive components were conjugated to these polymers: an antiDEC205 (aDEC205) antibody for specific targeting of CD8+ dendritic cells, an ovalbumin (OVA)-specific model antigen with the core peptide se-quence SIINFEKL which initiates a specific immune response against cancer cells presenting this antigen, and an oligonucleotide adjuvant (CpG1826) which targets the toll like receptor 9. The ability of the polymer-drug conjugate to activate DC to induce an immune response against OVA-expressing cancer cells was expected to be significantly enhanced by attaching the three components onto one polymeric carrier molecule.rnLinear PLL was investigated as a model system to establish the conjugation chemistry and to transfer it to the polylysine brush, which is a cylindrical brush polymer with poly-L-lysine side chains. With these two polymeric carriers two different topologies (coil and brush-like) were distinguished. The influence of the structural differences on conjugation reactions as well as on the final in situ and in vitro behavior was studied.rnPLL labeled with AlexaFluor488 was modified with thiol reactive maleimide groups using the bifunctional crosslinker sulfo-SMCC. Thiol modified CpG and thiol modified antigen-AlexaFluor546 were coupled to PLL through a Michael addition of the thiol to the maleimide groups. Subsequently, aDEC205-AlexaFluor647 was conjugated to PLL either via Schiff Base reaction of the oxidized antibody with PLL and following reduction to a stable secondary amine or via click reaction of PEG-azide modified antibody with a dicyclobenzyl cy-clooctylene (DIBO)-functionalized PLL.rnConjugation of the bioactive components to the polymer was confirmed using UV/Vis spec-troscopy, flow cytometry and confocal laser scanning microscopy. While the PLL brush alone showed very high cytotoxicity on HeLa and JAWS II cells, PLL and PLL-conjugates as well as PLL brush-conjugates exhibited no distinct cytotoxicity. The polymer conjugates revealed no aggregation in human blood serum which was detected by multi-angle light scattering. Con-focal laser scanning microscopy (CLSM) images demonstrated colocalization of all fluores-rncent dyes inside the cells which indicated successful conjugation and internalization of the conjugate. Flow cytometry measurements exhibited slightly increased internalization into bmDC of the targeted PLL-Antigen-aDEC205 conjugate compared to the untargeted PLL-Antigen. Flow cytometry measurements performed with the Specific Hybridization Internali-zation Sensor (SHIP) revealed an internalization of PLL-antibody conjugates into immature splenic CD8+ DC, but not into mature CD8+ DC which implied that conjugation of aDEC205 did not induce receptor-mediated endocytosis.rnT cell proliferation assays showed an activation of CD8+ T cells induced by all antigen-containing conjugates while conjugates without antigen served as negative controls and re-vealed no T cell activation. However, no difference was observed between targeted and un-targeted conjugates due to the unspecific uptake of the polymer. SIINFEKL alone also in-duced T cell proliferation at lower antigen concentrations. These results suggest that PLL-conjugates exhibited unspecific uptake into cells due to the high cationic charge and no re-ceptor-mediated endocytosis could be imparted by conjugation of the aDEC205 antibody.rnIn summary, it was possible to conjugate three biologically active components to one poly-meric carrier and characterize composition, size and activity of these hybrid materials. The polymer-conjugates are unspecifically internalized into DC and can induce an immune re-sponse, however, the antibody does not promote receptor-mediated endocytosis of the con-jugate. These studies offer a promising first step to developing new nanomaterials for appli-cation in cancer immunotherapy.
DDC: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1750
URN: urn:nbn:de:hebis:77-35275
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 181 S.
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