Authors:	Ostertag, Renate Magdalene
Title:	Characterisation of human co-culture systems for applications in bone tissue engineering
Online publication date:	12-Sep-2013
Year of first publication:	2013
Language:	english
Abstract:	For the successful integration of bone tissue engineering constructs into patients, an adequate supply with oxygen and nutrients is critical. Therefore, prevascularisation of bone tissue engineering constructs is desirable for bone formation, remodelling and regeneration. Co-culture systems, consisting of human endothelial cells and primary osteoblasts (pOB) as well as osteosarcoma cell lines, represent a promising method for studying the mechanisms involved in the vascularisation of constructs in bone tissue en- gineering and could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during angiogenesis. The present study demonstrated the im- portant components of co-culture systems with a focus on bone tissue replacement and the angiogenic eï¬ ects of pOB and osteosarcoma cell lines on human endothelial cells. Furthermore, the studies emphasised an overall approach for analysis of signal molecules that are involved in the angiogenic activation of human endothelial cells by the regulation of VEGF-related pathways at the transcriptional and translational levels. The osteosarcoma cell lines Cal-72, MG-63 and SaOS-2, as well as pOB from several donors, diï¬ ered in their angiogenesis-inducing potential in 2-D and 3-D co-culture systems. SaOS-2 cells appeared to have a high osteogenic diï¬ erentiation level with no detectable angiogenesis-inducing potential in co-culture with human endothelial cells. The angiogenic potential of the osteoblast-like cells is mainly correlated with the upregulation of essential angiogenic growth factors, such as VEGF, bFGF and HGF and the downregulation of the angiogenesis inhibitor, endostatin. However, other factors involved in angiogenic regulation were found to diï¬ er between SaOS-2 cells, compared to Cal-72 and MG-63. The present study focuses on VEGF pathway-eï¬ ecting genes as key players in the regulation of angiogenesis. The levels of VEGF and VEGF-eï¬ ecting genes, such as TGF-α and TIMP-2 are down-regulated in SaOS-2 cells. In contrast, direct regulators of VEGF, such as IL6, IL8 and TNF are strongly upregulated, which indicates disruptions in growth factor regulating pathways in SaOS-2 cells. Potential pathways, which could be involved include MEK, PI3K, MAPK, STAT3, AKT or ERK. Additional treatment of co-cultures with single growth factors did not accelerate or improve the angiogenesis-inducing potential of SaOS-2 cells. Knowledge of the detailed molecular mechanisms involved in angiogenesis control will hopefully allow improved approaches to be developed for prevascularisation of bone tissue engineering constructs. Für die erfolgreiche Integration von Knochenersatzmaterialien, ist die Versorgung mit Sauerstoï¬ und Nährstoï¬ en essentiell. Die Vaskularisierung dieser Materialien vor der Implantation in Patienten gilt als vorteilhaft für einen schnellen Anschluß des Implantats an das Gefäßsystem des peri-implantären Gewebes in vivo. Co-Kultur-Modelle aus humanen Endothelzellen und primären Osteoblasten (pOB), bzw. Osteosarcoma Zelllinien eignen sich für Vaskularisierungsstudien an Implantaten, können somit zur Verbesserung der Knochenregeneration beitragen und geben neue Einblicke in molekulare und zelluläre Mechanismen der Angiogenese. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Charakteristika von Co-Kultur Komponenten einen entscheidenden Einï¬ uss auf die Ausbildung von angiogenen Strukturen in vitro haben. So wurde sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translations-Ebene nach Signal-Peptiden gesucht, die in Endothelzellen Angiogenese stimulieren und Einï¬ uss auf die Regulation von Signalwegen haben könnten. Sowohl die Osteosarcoma Zelllinien Cal-72, MG-63 und SaOS-2, als auch pOB von verschiedenen Spendern zeigten unterschiedlich ausgeprägte angiogene Wirkungen in 2-D und 3-D Co-Kultur Modellen. SaOS-2 Zellen, die sich am deutlichsten osteoblastär diï¬ erenziert zeigten, konnte keine Angiogenese-induzierende Wirkung auf Endothelzellen nachgewiesen werden. Das Angiogenese-induzierende Potential von osteoblastären Zellen ist abhängig von der Konzentration angiogener Faktoren, wie VEGF, bFGF und HGF sowie der Absenz von Angiogenese Inhibitoren, wie Endostatin. In dieser Arbeit wurden SaOS-2, Cal-72 und MG-63 Zellen bezüglich angiogener Faktoren untersucht und verglichen. So konnte nachgewiesen werden, dass die VEGF Menge in SaOS-2 erniedrigt ist und Gene, welche in die Regulation von VEGF-Signalwegen involviert sind, wie TGF-α und TIMP-2, in SaOS-2 herabreguliert sind. Ausserdem wurden direkte VEGF-Regulatoren, wie IL6, IL8 und TNF erhöht vorgefunden, was auf Störungen in Wachstumsfaktor-regulierenden Signalwegen in SaOS-2 deuten könnte. Potentiell involvierte Signalwege sind MEK, PI3K, MAPK, STAT3, AKT oder ERK. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die monovariante Behandlung von Co-Kulturen mit Wachstumsfaktoren keinen Einï¬ uss auf die fehlende an- giogene Wirkung von SaOS-2 Zellen auf Endothelzellen hat. Ein besseres Verständnis der molekularen Kontrolle von Angiogenese könnte künftig zur verbesserten Vaskularisierung von Knochenersatzmaterialien führen.
DDC:	580 Pflanzen (Botanik) 580 Botanical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1742
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-35170
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	116 S.
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